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背景弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL),占成人NHL的30%～40%。DLBCL在临床特征、形态学、免疫组织化学及分子遗传学存在明显异质性。利妥昔单抗问世前,传统的蒽环类为基础的CHOP方案作为DLBCL的标准一线治疗,约1/3患者可获得长期生存。利妥昔单抗问世后,联合CHOP的免疫化疗方案明显提高DLBCL患者的长期生存率,约半数患者获得治愈或长期生存,但是仍有1/3的患者因疾病复发难治而死亡。改善复发难治DLBCL患者的预后是临床上的重要挑战。对淋巴瘤发病机制深入的理解和新药研发能力的进步催生了多种潜在的抗肿瘤药物,很多新型抗肿瘤药物在复发难治DLBCL中己经显示疗效。西达本胺(Chidamide)是我国自主研究的新一代酰胺类组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitors,HDACI),该药物通过表观调控增加组蛋白和非组蛋白乙酰化水平,促进抑癌基因表达,有效抑制肿瘤细胞周期,促进凋亡,同时增强微环境中免疫细胞的抗肿瘤作用。目前,西达本胺在外周T细胞淋巴瘤中展现良好疗效,已经被批准治疗外周T细胞淋巴瘤。但是,HDACI单药治疗DLBCL的疗效尚不理想。国外一项HDACI单药Mocetinostat针对复发难治DLBCL患者的临床研究中,客观反应率17%,疾病稳定32%,总获益率49%。西达本胺的探索性临床试验中,国内入组3例DLBCL,2例疾病稳定,1例进展;日本入组2例DLBCL患者,1例疾病稳定,1例进展。本项目为单中心、单臂探索性临床研究,评估西达本胺联合长春瑞滨、脂质体阿霉素、地塞米松和沙利度胺(VDDT)化疗方案治疗复发和难治DLBCL患者的疗效和安全性,旨在提高西达本胺单药治疗疗效,并探索疗效与驱动基因突变之间的关系。本项目同时开展西达本胺对DLBCL细胞株的体外实验,分析西达本胺敏感性与驱动基因突变的相关性。第一部分 西达本胺联合VDDT方案治疗复发或难治DLBCL的单臂前瞻性临床研究目的开展西达本胺联合VDDT方案治疗复发难治DLBCL单臂前瞻性临床研究,评估方案的疗效和安全性,探索驱动基因突变与疗效的关系。方法1.本研究为单中心单臂的探索性研究(clinicaltrials.gov,临床试验编号NCT02733380),入组患者符合入组和出排标准,采用2008年WHO造血与淋巴组织肿瘤诊断标准,均有可测量病灶。患者接受西达本胺联合VDDT方案治疗,根据试验方案设计进行剂量和治疗周期调整。记录并总结患者的临床、病理、分子特征、临床疗效和不良反应。2.疗效标准采用国际工作组的淋巴瘤疗效评价标准(IWG)。3.安全性评价按照NCI CTCAE V4.03标准。4.收集入组患者肿瘤组织,二代测序技术检测93个热点驱动基因突变情况。5.统计学分析采用统计软件SPSS 23.0版本。结果1.共纳入DLBCL患者8例,包括男性3例和女性5例,中位年龄53(44-73)岁,中位既往治疗线数2.5(2-5)个。2.8例DLBCL患者均没有完成计划的治疗周期数,中位治疗2(1-6)个周期,2例原发耐药导致疾病进展出组,6例毒性不能耐受出组,未发生治疗相关的死亡事件。疗效分析显示疾病控制率75%,包括部分缓解率25%(2/8)和疾病稳定率50%(4/8);疾病进展率25%(2/8)。中位随访178(30-427)天,疾病进展7例,死亡7例,中位无进展生存和总生存分别为36(26-150)天和178(30-427)天。3.安全性分析显示1-4级血液毒性发生率100%,包括白细胞减少100%、中性粒细胞减少87.5%、血小板减少75%、贫血62.5%;3-4级血液毒性发生率75%,包括白细胞减少62.5%、中性粒细胞减少75%、血小板减少37.5%。1-4级非血液毒性发生率为87.5%,包括乏力75%,胃肠道毒性75%,肝脏毒性62.5%,电解质紊乱37.5%,疼痛37.5%,感染12.5%。3级非血液学毒性发生率为12.5%,表现为乏力,无4级非血液学毒性发生。4.8例患者中5例检测驱动基因突变,共检测出23个基因发生突变,中位基因突变频数6(3-10)个,基因突变频数与疾病控制呈负相关(r=-0.949,P=0.014)。高频突变基因包括 CD79B(60%,3/5)、TNFRSF14(40%,2/5)、TP53(40%,2/5)和PIM1(40%,2/5),CD79B和TNFRSF14基因突变与疾病控制呈负相关(r=-0.913,P=0.03),TP53和PIM1基因突变与疾病控制无关。热点驱动基因中具有表观调控功能的包括组蛋白甲基化调控相关基因KMT2D/MLL2、SETD2、KMT2A、EZH2、IDH2和TET2,组蛋白乙酰化调控相关基因EP300、CREBBP,DNA甲基化基因DNMT3A,染色质重塑基因ARID1B。1例患者检测到EP300突变,1例患者检测到KMT2D/MLL2突变,未检测出未检测出其它表观调控基因突变。EP300和KMT2D/MLL2基因突变与疾病控制率无关。结论1.西达本胺联合VDDT方案治疗复发难治DLBCL的疾病控制率优于西达本胺单药,但是联合方案毒副作用发生率较高,患者耐受性差,需要调整联合治疗方案。2.复发难治DLBCL患者中驱动基因突变情况复杂,基因突变频数高和伴随CD79B、TNFRSF14基因突变的患者联合治疗疗效差,与表观遗传调控基因突变无关。第二部分 西达本胺疗效与驱动基因突变相关性的体外研究目的分析西达本胺对DLBCL细胞凋亡作用与驱动基因突变关系。方法1.六种 DLBCL 细胞株 OCI-Ly3、OCI-Ly7、OCI-Ly8、Dohh2、Ros50 和 Val经复苏、培养、传代后用于体外研究。2.流式细胞术检测西达本胺诱导的细胞凋亡。3.二代测序技术检测6种细胞株中93个热点驱动基因突变情况。结果1.10μmol/L西达本胺处理6个DLBCL细胞株48小时,流式细胞术检测发现不同细胞株的凋亡率显著不同,分别为OCI-Ly7细胞83.22%、Ros50细胞76.97%、OCI-Ly8 细胞 68.92%、OCI-Ly3 细胞 21.78%、Dohh2 细胞 2.73%和 Val细胞2.18%。2.6种DLBCL细胞中检测出的基因突变频数显著不同,分别为OCI-Ly7细胞 8 个、Ros50 细胞 13 个、OCI-Ly8 细胞 22 个、OCI-Ly3 细胞 12 个、Dohh2细胞37个和Val细胞37个,基因突变频数与凋亡率呈负相关(r=-0.812,P=0.05)。6种DLBCL细胞中检测出30种驱动基因发生突变,最常见的突变基因是MYC和BCL2,MYC和BCL2双突变与凋亡无相关性。Dohh2和Val细胞中发现CD79B基因突变,CD79B突变与凋亡呈负相关(r=-0.828,P=0.042)。细胞中未发现TNFRSF14基因突变。OCI-Ly3细胞中发现EP300突变,OCI-Ly8、Dohh2和Val细胞中发现CREBBP突变,OCI-Ly3、Dohh2和Val细胞中发现KMT2D/MLL2突变,Dohh2、Ros50和Val细胞中发现EZH2突变,Ros50细胞中发现ARID1B突变,无检测出其它表观调控基因突变。EP300、CREBBP、EZH2和ARID1B突变与凋亡无相关性,KMT2D/MLL2突变与凋亡呈负相关(r=-0.878,P=0.021)。结论西达本胺诱导DLBCL细胞凋亡与驱动基因突变频数和CD79B基因突变呈负相关,与 EP300、CREBBP、EZH2 和 ARID1B 突变无相关,与 KMT2D/MLL2突变呈负相关。总结论1.西达本胺联合VDDT方案治疗复发难治DLBCL的疾病控制率优于西达本胺单药,但是联合方案毒副作用发生率较高,患者耐受性差,需要调整联合治疗方案。2.复发难治DLBCL患者中驱动基因突变情况复杂,基因突变频数高和伴随CD79B、TNFRSF14基因突变的患者联合治疗疗效差,与表观遗传调控基因突变的关系尚不明确。