苹果锈果类病毒对果树危害极大。近年来,苹果锈果类病毒在我国苹果主产区有蔓延趋势,严重制约了我国苹果产业的健康发展。目前,对苹果锈果类病毒的发生规律知之甚少,尚无有效的防治措施。本研究利用实时荧光PCR技术建立并优化了苹果锈果类病毒检测体系,并利用该体系研究苹果锈果类病毒在树体内的时空分布规律,以期为苹果锈果类病毒的检测取样和防治提供依据。同时,研究了苹果锈果类病毒对果实花青苷合成及相关基因在转录水平的影响,以期深入了解其发病机理。主要研究结果如下:1.苹果锈果类病毒实时荧光PCR方法的建立及优化建立了苹果锈果类病毒的实时荧光PCR检测方法,并对体系的特异性、灵敏性、适用性及重复性进行验证。研究表明:(1)灵敏度高,实时荧光PCR体系灵敏度高于常规RT-PCR100倍;(2)引物特异性强,能特异检测ASSVd,对苹果的其它三种病毒ACLSV、ASGV、ASPV未能检测出;(3)适用性广,可检测出花蕾、叶片、根皮及枝皮不同组织的ASSVd;(4)重复性好,重复3次测定100、10-1、10-2高、中、低3个浓度的c DNA模板,Ct值的变异系数均在误差范围内。通过设计不同的引物浓度和退火温度对本试验建立的检测方法进行优化,证明10μmol/L的引物浓度和60℃的退火温度为最优。2.苹果锈果类病毒河北分离物的克隆及序列分析本研究以表现苹果锈果类病毒症状的5个不同品种(斗南、嘎拉、华硕、中秋王、富士)的苹果果实为材料。运用RT-PCR检测确认其携带ASSVd后进行基因克隆并测序,共得到14条不同的序列。运用DNAMAN6.0分析所得的14条不同序列,同源性达98.49%,与NCBI报道的新疆、北京、韩国等地的ASSVd序列高度同源,同源性达95.35%。表明ASSVd序列的变异与品种没有明显相关性。3.苹果锈果类病毒的时空分布规律本试验以携带ASSVd的富士苹果树为试材,利用建立的苹果锈果类病毒实时荧光PCR方法对其叶片、枝皮、根皮和果实进行检测,表明苹果锈果类病毒在树体内的时空分布存在差异:(1)树冠下层组织的病毒相对含量要高于树体上层对应组织的病毒含量;(2)幼嫩组织的病毒相对含量低于成熟组织;(3)高温季节的病毒含量要低于低温季节。综合试验全部采样期中ASSVd在树体内的表达量结果,我们得出12月份根皮组织中ASSVd的相对表达量为最高。因此采集该时期的根皮组织进行检测的结果最为可靠。4.苹果锈果类病毒对花青苷合成及相关基因的影响(1)携带ASSVd苹果果皮和健康苹果果皮在解袋后的第0天到第14天的6个采集期,花青苷含量的变化均呈上升的趋势,但健康果皮的花青苷含量均显著高于感病果皮。(2)对花青苷合成的相关结构基因的研究中发现:解袋后第0天,健康果皮的Md CHS、Md F3H、Md DFR、Md ANS、Md UFGT的相对表达量均比感病果皮高。在解袋后的第2天到第14天,除Md F3H外,其它4种基因的相对表达量在健康果皮中一直高于感病果皮;对花青苷合成的相关调节基因的研究中发现:解袋后第0天健康果皮中Md BHLH33和Md MYB11的相对表达量显著高于感病果皮,随后Md BHLH33、Md TTG1和Md MYB11的表达水平在感病果皮中一直低于健康果皮。这表明ASSVd影响了果皮中花青苷合成相关基因的转录水平。(3)健康果皮与感病果皮中花青苷相关基因的相对表达量与花青苷含量相关性不同。健康果皮中结构基因Md UFGT与Md DFR的相对表达量与花青苷含量呈显著正相关,其中Md DFR相对表达量与花青苷含量正相关性极显著(相关系数0.923);而感病果皮中只有结构基因Md ANS的相对表达量与花青苷含量呈显著正相关,其它相关性不显著。