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生命体中各种生理功能的执行往往伴随着蛋白质之间的相互作用,对其研究有助于增进我们对蛋白质相互作用网络的解析、信号转导通路的确定以及药物靶点的发现,对疾病诊断和药物开发都具有指导作用。基于腺苷酸环化酶重构的细菌双杂交(BACTH)系统是活细胞体内研究蛋白一蛋白相互作用重要手段,蛋白质相互作用使腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)功能重建继而催化生成cAMP,生成的cAMP与lac启动子上的分解代谢蛋白结合,激活报告基因表达。与此同时,相互作用蛋白的表达同样受到lac启动子调控,这意味着当蛋白质发生相互作用时生成的cAMP有助于诱导表达更多的相互作用蛋白。如果蛋白质未发生相互作用,不仅无法激活报告基因表达,相互作用蛋白表达量也处于非常低丰度。所以,在BACTH系统中,报告基因的表达量除了与相互作用蛋白结合强度有关,还受到相互作用蛋白表达量的影响。另外,细菌生长过程中质粒分配的不均性和基因表达的随机性使细菌在蛋白表达存在异质性。传统的细菌双杂交实验以平板显色法和比色定量法对lacZ报告基因表达的β-半乳糖苷酶检测,获得的结果是大量细菌表达蛋白的集权平均结果,掩盖了细菌蛋白表达个体差异;且不能同时对相互作用蛋白表达进行分析,因此无法建立相互作用强度与报告基因之间的数量关系,只能定性分析蛋白质相互作用而无法准确定量。本课题组前期研究工作将BACTH系统与流式细胞术相结合,采用双色免疫荧光染色,实现单细菌水平报告基因和相互作用蛋白的定量检测,并提出“相对报告基因表达量”,即单位相互作用蛋白表达所产生的报告基因表达量作为量化指标,发展了一种灵敏、高通量的蛋白质相互作用定量检测方法。荧光蛋白是一种活细胞荧光标记的重要手段,能形成内部发色团,无需添加任何辅助因子,可直接对其荧光表征,实现天然状态下细胞生化分析。双砷染料也是一种适用于活细胞蛋白标记的荧光探针,而且TC标签序列小,标记速度快,不会干扰融合蛋白功能的行使。本文在前期建立的方法基础上进行改进,将荧光蛋白和双砷染料一四半胱氨酸体系联用对BACTH系统中报告基因和相互作用蛋白定量分析,发展一种更加便捷、通用性强的蛋白质相互作用定量检测新方法。第一章为文献综述。重点介绍了蛋白质相互作用的研究方法、单细菌水平研究BACTH的重要性和超高灵敏流式检测技术在细菌检测中的应用,以及本论文的选题思路和研究方法。第二章建立tdTomato-BACTH系统报告基因和相互作用蛋白的双荧光检测方法。以Pal-TolB为模型,在报告菌株基因组asl区域敲入tdTomato荧光蛋白作为蛋白一蛋白相互作用的报告基因,建立以荧光蛋白为报告因子的tdTomato-BACTH系统。并且在承载AC互补片段T25和相互作用蛋白TolB的低拷贝质粒载体上插入TC-tag,使其融合表达,利用跨膜性双砷染料特异性的标记TC-tag。通过对双砷染料的染色方法、使用浓度以及HSFCM的双荧光检测条件优化,将双砷染料—四半胱氨酸体系与tdTomato荧光蛋白联用,实现对相互作用蛋白TC-TolB和tdTomato报告基因的双荧光检测。第三章建立tdTomato-BACTH系统蛋白—蛋白相互作用定量检测方法。为提高双砷染料标记的荧光信号,本章将AC互补片段T25和T18及两个相互作用蛋白的基因都构建在高拷贝质粒上成单质粒型相互作用蛋白对串联表达载体,提高了单个细菌蛋白表达量。通过考察同种双杂交细菌不同单菌落相互作用蛋白和tdTomato报告基因表达量关系,发现相互作用蛋白和tdTomato报告基因表达量存在线性相关。对于同一相互作用蛋白对,测定的相对报告基因表达量(扣除背景的tdTomato荧光信号与FlAsH荧光信号强度中位值的比值)接近恒定值。我们以一系列相互作用强度已知的蜷曲螺旋蛋白En-Kn为研究对象,验证了以tdTomato荧光蛋白为报告因子,TC标签标记相互作用蛋白表达量测定的相对报告基因表达量与蛋白相互作用强度具有较好的相关性,成功发展了一种便捷、通用性强的蛋白质相互作用定量检测新方法。第四章tdTomato-BACTH系统蛋白质相互作用位点的鉴定。本章将质粒转化后的细菌直接在含有相应抗生素的液体LB中培养,采用流式在单细菌水平选择性地对表达tdTomato报告基因的细菌分析,相较于常规细菌双杂交实验省去了质粒转后细菌在筛选平板上48 h以上的培养步骤,成功建立一种基于tdTomato报告基因蛋白一蛋白相互作用快速检测方法。另外,TBE是大肠杆菌素ColE9与TolB相互作用的主要功能区域,以TBE与TolB相互作用为模型,将本章建立的基于tdTomato报告基因蛋白一蛋白相互作用快速分析方法应用于对TolB和TBE突变体相互作用的检测,实现对蛋白质相互作用关键位点(突变后相互作用消失)快速鉴定。利用第三章建立的蛋白一蛋白相互作用定量检测方法进一步对TolB和TBE突变体相互作用强度分析,通过相对报告基因表达量的测定有效地对TBE与TolB相互作用位点(突变后仍产生相互作用,但相互作用强度降低)进行分析,实现不同位点对蛋白质相互作用强度影响程度的判断。结果表明建立的tdTomato-BACTH系统蛋白质相互作用研究方法能够实现对蛋白质相互作用位点的鉴定并对不同位点的关键性进行排序。第五章总结与展望。总结本论文的工作,并对后续的研究内容进行展望。