【摘 要】
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铝毒是酸性土壤中影响植物生长、导致农作物减产的一个重要因素,我国华南地区的酸性土壤中铝毒危害日渐严重,传统的撒石灰等物理化学方法会对土地资源造成不可逆的伤害,所以探究开发出新型的生物处理方法,是解决土壤铝毒害对农作物生长影响的必经之路。植物在生长过程中会进化出一系列的抗铝机制,而水通道蛋白家族已经被证实具有转运铝,减轻铝毒害的作用,因此克隆相关水通道蛋白基因,构建基因工程菌株,用于铝毒危害严重的环
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铝毒是酸性土壤中影响植物生长、导致农作物减产的一个重要因素,我国华南地区的酸性土壤中铝毒危害日渐严重,传统的撒石灰等物理化学方法会对土地资源造成不可逆的伤害,所以探究开发出新型的生物处理方法,是解决土壤铝毒害对农作物生长影响的必经之路。植物在生长过程中会进化出一系列的抗铝机制,而水通道蛋白家族已经被证实具有转运铝,减轻铝毒害的作用,因此克隆相关水通道蛋白基因,构建基因工程菌株,用于铝毒危害严重的环境修复,具有重要的现实意义。本论文以水稻OsNIP1-2水通道蛋白基因作为研究对象,利用经CRISPR-Cas9法敲除水稻中OsNIP1-2基因获得的突变体和野生型水稻为材料,分析突变体水稻与野生型水稻在铝胁迫下的生长状况差异以及植物体内各部位的铝含量,阐明OsNIP1-2在水稻耐铝毒中的作用;进而构建OsNIP1-2基因工程菌株,并分析其功能和在解铝毒中的应用。获得的主要研究结果如下:(1)敲除OsNIP1-2基因后的osnip1-2水稻突变体的体内铝转运途径受阻,导致铝在最敏感的细胞壁中积累,并降低了铝从敏感的根部到地上部的转运效率,说明OsNIP1-2蛋白参与了铝在水稻体内的转运过程。(2)构建OsNIP1-2基因的酵母表达载体,并成功转化酵母BY4741菌株,筛选获得OsNIP1-2工程菌株。对该工程菌株在铝胁迫下的异源表达和生长曲线的分析结果表明,表达OsNIP1-2蛋白的菌株会增加铝离子在其体内的积累,导致自身生长速率比只含空载体(pYES2)的菌株慢,说明表达OsNIP1-2的工程菌株构建成功。(3)为进一步探究表达OsNIP1-2蛋白的工程菌株体内代谢通路的变化,在无铝胁迫的生长情况下,通过LC-GC法识别出表达OsNIP1-2基因前后具有浓度差异的代谢物,经过单变量与多变量分析的共同计算,筛选出151种差异代谢物组分及对应的差异代谢通路,结果表明表达水通道蛋白OsNIP1-2的表达会使酵母菌株的氨基酸代谢和核苷酸代谢出现显著性变化,说明目的蛋白的表达加快了菌株的氨基酸代谢和核苷酸代谢途径,可能与其参与铝的转运过程有关。(4)通过工程菌株的功能验证分析,表明工程菌株的最佳吸收铝的条件为:接种量为5%、p H=4.2、初始铝浓度为50μM、吸收时间2 h。(5)工程菌株对铝离子的吸收量和对污染水体中铝的去除率均比对照组高。(6)工程菌株在与玉米的共培养试验表明,工程菌株对铝毒有一定的缓解作用,能够促进玉米在铝毒胁迫条件下生长;通过红外吸收光谱对吸附铝前后的菌株进行研究,表明OsNIP1-2工程菌株对污水中Al3+的去除主要以吸收为主,吸附起到较少的帮助,吸收Al3+前后其结构和成分仍然保持完整。(7)该工程菌株可用于污染水体中铝的去除和缓解酸性土壤中铝毒对作物生长的危害。提供了一种有效的策略,所构建的工程菌株作为铝胁迫植物促生方面显示出很大的应用潜力。
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