论文部分内容阅读
研究目的:三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是最致命的乳腺癌亚型。由于缺乏有效的治疗策略,患者往往客观缓解率（objective response rate,ORR）低,预后不良。随着肿瘤免疫学的发展,调控机体免疫系统在多种恶性疾病中成为了一种富有吸引力的治疗策略。尽管之前的观点认为乳腺癌是一种免疫原性较低的肿瘤类型,然而最近的研究表明,TNBC的免疫细胞浸润相较于其他乳腺癌亚型明显增多。同时,肿瘤局部淋巴细胞的浸润程度与TNBC患者的预后显著相关。槐耳（Trametes robiniophila Murr）属层菌纲（Hymenomycetes）,担子菌门（Basidiomycota）。最初被李时珍记载于《本草纲目》,槐耳在我国民间用于治疗疾病已有约1600年的历史。现代生物学研究表明,作为一种具有免疫调节作用的传统草药,槐耳在TNBC的治疗中有显著的抑癌效果。然而,其机制仍有待阐明。研究方法及结果:在本研究中,我们拟从TNBC特殊的免疫浸润类型入手,研究槐耳治疗TNBC的分子机制。具体内容包括以下3个方面:第一部分TNBC中免疫原性细胞死亡相关风险模型的构建研究方法:基于国际乳腺癌分子分类学联盟（molecular taxonomy of breast cancer international consortium,METABRIC）数据集,通过微环境细胞种群计数器（microenvironment cell populations counter,MCP-counter）算法对 TNBC的肿瘤浸润细胞完成量化并聚类分析,利用Kaplan-Meier法选择对TNBC患者总生存期影响最为显著的肿瘤浸润细胞。将METABRIC队列通过随机数表法均等分为为训练集与验证集,采用训练集建立免疫细胞浸润相关的TNBC预后预测模型,随后分别在训练集与验证集中通过Kaplan-Meier生存分析和时间依赖的ROC曲线评估模型的预后价值,进而探讨TNBC的免疫环境特征。研究结果:TNBC中,T细胞和树突状细胞（dendritic cells,DC）浸润与患者的总生存期呈显著正相关并对降低TNBC的复发风险至关重要。T细胞和DC细胞是免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）的中心环节,该免疫特征提示TNBC的预后可能与ICD密切相关。因此我们在METABRIC训练集中基于肿瘤浸润T细胞及DC细胞建立了 ICD相关风险模型（ICDscore）并在训练集及验证集中进行了验证。这些发现均证明了 ICD在TNBC进展中的核心作用。第二部分槐耳诱导TNBC免疫原性细胞死亡研究方法:我们利用流式细胞术及免疫荧光实验检测了槐耳处理对TNBC细胞表面钙网蛋白（calreticulin,CRT）表达量的影响,通过三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）检测试剂盒测定槐耳处理后细胞上清中ATP浓度的变化,采用westernblot蛋白印迹实验检测细胞膜蛋白中的CRT含量以及细胞上清中高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1,HMGB1）的富集情况。提取小鼠骨髓来源的DC细胞并与槐耳处理后的TNBC共培养,流式细胞术分析DC细胞表面标记物的变化,并通过体内实验探究CD8+T细胞在槐耳介导的肿瘤抑制中发挥的功能。利用Balb/c小鼠建立TNBC皮下肿瘤模型比较槐耳灌胃治疗,程序化细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1,PD-1）抑制剂腹腔注射,以及双药物联合应用对肿瘤的治疗效果。期间定期监测肿瘤生长情况以及小鼠体重变化。肿瘤样本经福尔马林固定后制作石蜡切片,经免疫组织化学染色实验对肿瘤免疫微环境中T淋巴细胞的浸润情况进行评估。研究结果:槐耳可通过促进细胞表面CRT暴露,增加ATP和HMGB1的释放,在TNBC细胞中诱导ICD的发生。将DC细胞与槐耳处理后的TNBC细胞共培养可有效促进DC细胞成熟。基于细胞的体内疫苗接种试验进一步验证了这一结论。在小鼠皮下肿瘤模型中,槐耳灌胃处理可导致TNBC局部淋巴细胞浸润增多,并有效减缓肿瘤生长。同时,通过特异性抗体耗竭内源性T细胞可消除槐耳对TNBC的治疗作用。槐耳灌胃辅助下的PD-1抑制剂治疗可显著抑制TNBC的进展,治疗效果优于单药组,且对小鼠体重无明显影响。在免疫组织化学染色实验中,双药联合组肿瘤微环境中T淋巴细胞浸润显著增加,进一步证明了槐耳在临床应用中可作为辅助治疗药物通过诱导ICD改善免疫检查点抑制剂对TNBC患者的治疗效果。第三部分槐耳诱导免疫原性细胞死亡的分子机制研究方法:在TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中利用基因表达谱筛选槐耳处理前后差异表达的信使核糖核酸（message ribonucleic acid,mRNA）,并通过基因本体（GeneOntology,GO）分析寻找槐耳诱导ICD的相关分子通路。采用westernblot蛋白印迹实验对生物信息学分析的结果进行验证。为确定槐耳激活内质网应激通路的机制,我们将槐耳处理/未处理的MDA-MB-231和MDA-MB-468 细胞环状 RNA（circular RNA,circRNA）表达谱使用 R 语言"limma"包进行分析,筛选差异表达的circRNA并通过实时定量PCR进行了验证。使用RNA pulldown及质谱实验探索circRNA的下游结合蛋白并经RNA免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）实验,荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）实验及免疫荧光实验进行了验证。研究结果:对细胞组分（cellular component,CC）的分析中,槐耳处理后差异表达的mRNA与内质网显著相关,而对生物过程（biological process,BP）的分析中,这些mRNA在“内质网应激反应”和“RNA聚合酶Ⅱ启动子在内质网应激反应中的转录正调控”中表现出明显富集。提示槐耳诱导的ICD可能与内质网应激的发生有关。生物学实验中,westernblot蛋白印迹实验结果表明槐耳可显著增强eIF2α的磷酸化,进而诱发内质网应激相关ICD的发生。利用生物信息学方法对RNA测序结果进行分析后发现,circCLASP1的表达量在槐耳处理后的TNBC细胞中显著升高。体外实验证实circCLASP1在槐耳诱导的eIF2α磷酸化中至关重要。PKR/eIF2α/ATF4是内质网应激的重要通路,进一步研究表明,circCLASP1可与细胞质中的PKR结合并引起其蛋白水平升高,从而诱发槐耳介导的内质网应激通路的激活,促进ICD的发生。结论:1.基于METABRIC数据库构建了 TNBC的ICD相关预后预测模型。2.槐耳可在TNBC中有效诱导ICD激活。3.经槐耳处理的TNBC细胞可在小鼠体内疫苗实验中激活免疫反应。4.PD-1抑制剂与槐耳联合应用可显著减缓TNBC进展。5.槐耳在TNBC中经circCLASP 1/PKR/eIF2α/ATF4信号途径调控内质网应激介导的ICD激活。意义:综上所述,本研究通过生物信息学方法分析了 TNBC的免疫学特征,提出了基于DC细胞与T细胞的预后风险模型,强调了 ICD在TNBC进展过程中的关键地位。槐耳作为我国传统中药具有显著的免疫调节功能,而分子机制尚未明确。本研究中,我们通过体内外实验阐述了 circCLASP 1/PKR/eIF2α/ATF4信号通路在槐耳诱导的ICD中的重要作用,同时为槐耳与免疫检查点抑制剂在临床实践中的联合应用提供了理论依据。我们的研究结果具有显著的临床转化潜力,为实现TNBC患者的长期缓解带来了新的希望。