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蛋白酶是生物体内一种可以分解蛋白质或多肽的一种酶。蛋白酶广泛存在于各种生物体中,参与并调控食物消化、血液凝结、细胞凋亡等多种生理过程。研究表明,包括心血管疾病、癌症、阿兹海默症等在内的多种疾病都会导致患者血清中的某些蛋白酶含量异常升高。目前,蛋白酶标志物的检测包括高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)等方法,但是上述方法需要使用复杂、昂贵的仪器,不便实现床边检测(Point-of-caretest,POCT)。因此,开发一种可以快速、高灵敏检测蛋白酶的新型材料对心血管疾病、癌症等重大疾病的早期诊断具有重要意义。本论文的第一部分,通过表面引发原子转移自由基聚合(SI-ATRP)在二氧化硅纳米粒子表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)聚合物刷并对其进行多肽功能化修饰(CGGGGGRGGK-FITC或CGGGGGWGGK-FITC)。当聚合物刷上的多肽底物被蛋白酶水解,释放出荧光标记的多肽残基(GGK-FITC),经过离心、超滤分离后用荧光显微镜检测反应液中的荧光强度,从而定量表征溶液中蛋白酶的最低检测极限(LOD)及其酶促反应动力学参数(Km,vmax,kcat等)。二氧化硅纳米粒子上PMAA聚合物刷和多肽的接枝量可以通过ATRP反应中的单体浓度调控。由于PMAA聚合物刷具有三维空间结构,因此在后续多肽功能化修饰中多肽的接枝密度(22.4肽链/nm2)显著高于自组装单分子层(SAM)上修饰的多肽接枝密度(约0.1肽链/nm2)。以上述多肽功能化的PMAA聚合物刷为底物,该材料在Tris缓冲溶液(pH 8.0)与牛血清中检测胰蛋白酶的LOD可以分别达到1.4 pM和2.6 nM。该多肽功能化PMAA聚合物刷用于蛋白酶检测具有较好的普适性。通过设计多肽的氨基酸序列(KKGGPLGLAGGK-FITC)并用其进行PMAA的功能化修饰,该材料可以用来检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2),其LOD为1.1pM。上述多肽功能化PMAA聚合物刷可以用于高灵敏蛋白酶检测,但是该方法依赖离心、超滤过程将蛋白酶水解的多肽残基与母液分离,进而进行荧光表征。上述分离、纯化过程限制了该方法在床边检测(POCT)中的应用。为了解决这一问题,本论文的第二部分首先在玻璃基板表面构建聚丙烯酰胺凝胶微阵列和聚乙二醇(PEG)微柱环,当多肽功能化PMAA聚合物刷上的多肽底物被蛋白酶水解,释放出的多肽残基(GGK-FITC)可以进入聚丙烯酰胺凝胶微阵列的高分子网孔,未被蛋白酶水解的多肽仍留在聚合物刷上,不会进入到聚丙烯酰胺凝胶网孔中,从而实现多肽残基的分离与蛋白酶检测。该方法在Tris缓冲溶液(pH 8.0)与牛血清中检测胰蛋白酶的LOD分别为157 pM和243 nM。该方法在Tris缓冲溶液中(pH 8.0)检测MMP-2和MMP-9的LOD分别为1.67 nM和1.22 nM。由于被蛋白酶水解的多肽残基在聚丙烯酰胺凝胶微阵列中会伴随芯片的清洗过程扩散逸出,造成上述方法检测蛋白酶的LOD并不理想。为了解决这一问题,在聚丙烯酰胺的高分子链段中引入β-环糊精(β-CD),并在多肽底物上修饰金刚烷(Ad)官能团,通过Ad/CD超分子相互作用提高多肽残基在聚丙烯酰胺高分子网络中的捕获效率,从而提高检测灵敏度。改进后的方案在缓冲溶液中检测胰蛋白酶的LOD为13.2 pM,检测灵敏度比采用未经β-CD修饰的聚丙烯酰胺凝胶微阵列提高约12倍。综上,本论文构建了一种新型的多肽功能化聚甲基丙烯酸聚合物刷,其研究成果为快速、高灵敏检测血清中的蛋白酶活性提供了一种新的设计思路,为将来实现蛋白酶床边检测(POCT)奠定了研究基础。