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第一部分HIF-2α和VM在胰腺癌中的表达及临床意义目的研究缺氧诱导因子2(HIF-2α)和血管生成拟态(VM)在胰腺癌的表达,并进一步探究HIF-2α和VM在胰腺癌中的临床意义。方法(1)用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测70例胰腺癌患者癌组织和配对的非癌胰腺组织标本中HIF-2α蛋白的表达。(2)分析70例胰腺癌组织中HIF-2α表达与临床病理因素之间的相关性。(3)用PAS/CD34双染方法检测70例胰腺癌VM的表达情况,并分析其与临床病理因素之间的相关性。(4)分析在胰腺癌中HIF-2α和VM的表达相关性。(5)用log-rank test方法分析HIF-2α和VM对胰腺癌患者生存分析曲线,并进一步采用单因素及多因素分析研究影响胰腺癌预后的可能因素。结果(1)HIF-2α主要表达于细胞胞质及胞核,在胰腺癌组织中阳性率为67.1%(47/70),在相应非癌胰腺组织中阳性率为11.4%(8/70)。HIF-2α在胰腺癌组织中的阳性率明显高于非癌胰腺组织,两者的差异有统计学意义(χ2=45.549,P<0.05),而且HIF-2α的表达与肿瘤分化程度、肿瘤分期及淋巴结转移密切相关,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)我们用PAS/CD34双染法发现70例非癌胰腺组织中无VM典型结构(0/70,0%),只有CD34阳性结构出现;70例胰腺癌组织中有36例(36/70,51.4%)具有典型的VM结构,且VM的表达与肿瘤分化程度、肿瘤病理分期及淋巴结转移密切相关,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)胰腺癌组织中HIF-2α的表达与VM的表达呈正相关关系(Spearman,r=0.294,P<0.05)。(4)。采用Kaplan-Meier曲线评估表明:HIF-2α阳性表达胰腺癌患者生存期明显低于阴性表达患者(log-rank test,P<0.05);VM阳性表达胰腺癌患者生存期明显低于阴性表达患者(log-rank test,P<0.05)。(5)胰腺癌患者生存期的影响因素单因素分析表明胰腺癌患者的生存时间与胰腺癌的临床分期(P=0.001)、淋巴结转移(P=0.001)、HIF-2α表达(P=0.001)和VM表达(P=0.001)有关;多因素分析表明HIF-2α(HR=4.694,P=0.001)和VM(HR=5.857,P=0.012)分别是胰腺癌患者生存期的独立危险因素。结论HIF-2α蛋白和VM结构都在胰腺癌中高表达,并且胰腺癌组织中HIF-2α蛋白和VM的高表达与肿瘤分化程度、肿瘤分期及淋巴结转移密切相关。胰腺癌组织中HIF-2α的表达与VM的表达呈正相关性,且高表达HIF-2α或VM缩短了胰腺癌患者的生存时间。影响因素的单因素和多因素分析表明,HIF-2α和VM分别是胰腺癌患者生存期的独立危险因素,提示HIF-2α和VM表达与胰腺癌患者生存预后密切相关。第二部分HIF-2α促进胰腺癌细胞血管拟态形成的作用和机制研究目的观察在胰腺癌细胞中HIF-2α对VM的作用,并进一步探讨可能的调控机制。方法(1)构建针对HIF-2α基因的小干扰RNA载体和过表达载体,通过慢病毒转染人胰腺癌细胞,采用聚合酶链反应(PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测靶向调控HIF-2α的效果。(2)在胰腺癌细胞中调控HIF-2α的表达后,通过侵袭实验(cell invasion assay)和划痕实验(wound healing assay)观察HIF-2α对胰腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响,并通过Western blot检测HIF-2α对VM相关蛋白的作用。(3)通过三维培养(3D cultures)方法在体外检测调控HIF-2α的表达对胰腺癌细胞VM形成的影响。(4)在胰腺癌细胞中调控HIF-2α后通过Western blot检测VM相关蛋白表达的变化。(5)通过通过Patch软件系统预测VE-cadherin的可能转录区域和结合位点,并通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)方法研究Twist1/2与VM特异性蛋白VE-cadherin的作用与位点。(6)在胰腺癌细胞中通过荧光素酶实验(Luciferase assay)检测Twist对VE-cadherin基因的转录的调控效应。结果(1)靶向HIF-2α的慢病毒干扰和过表达载体成功包装出病毒,重组慢病毒载体分别成功转染As PC-1和SW1990细胞,转染率大于90%;PCR和Western blot检测证实重组慢病毒干扰和过表达HIF-2α的效率(P<0.05;P<0.05)。(2)上调HIF-2α表达后,胰腺癌细胞的侵袭及转移能力增强,下调HIF-2α表达后胰腺癌细胞的侵袭及转移能力下降。(3)在As PC-1细胞株中,si-HIF-2α组管腔样网状结构的数目(8±2/HP)明显少于si-Scramble组(37±5/HP),差异有统计学意义(P<0.05)。同样,在SW1990细胞株中,OE-HIF-2α组形成管腔样网状结构的数目(51±6/HP)明显多于Vector组(14±3/HP),差异有统计学意义(P<0.05)。(4)在胰腺癌细胞中HIF-2α调控VM相关蛋白的表达,即上调HIF-2α后,VE-cadherin、Twist1、Twist2、MMP2和MMP9的表达均上升(P<0.05);下调HIF-2α后,VE-cadherin、Twist1、Twist2、MMP2和MMP9的表达均下降(P<0.05)。(5)通过Patch软件系统预测VE-cadherin的转录因子Twist1/2可能结合位点有P1(-421bp)、P2(-714bp)、P3(-2000bp))和P4(-2110bp),Ch IP实验证实Twist1特异性结合到VE-cadherin启动子区P1和P4两个位点。(6)在胰腺癌细胞中通过Luciferase assay检测表明预测到的VE-cadherin基因启动子上Twist1的转录结合位点序列P1和P4增加了核心启动子的转录活性。结论在胰腺癌细胞中HIF-2α参与VM的发生发展,促进胰腺癌的侵袭和转移。VM转录因子Twist1可与VE-cadherin的启动子区结合,HIF-2α可能是通过调控Twist1结合到VE-cadherin,参与胰腺癌VM形成的发生。第三部分靶向下调和上调HIF-2α对胰腺癌细胞血管拟态形成作用的体内实验目的在动物体内观察HIF-2α对胰腺癌VM形成的影响,并进一步探讨和验证可能的调控机制。方法分别建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤模型,分别干预治疗,IHC验证基因调控效果。在原位瘤中,观察肿瘤的生长情况、有无腹水、有无腹腔其他脏器转移、原位瘤体积大小、原位移植瘤VM表达情况及VM相关蛋白表达水平。结果(1)在裸鼠原位瘤中,在As PC-1细胞中,si-Scramble组裸鼠原位瘤体积明显大于si-HIF-2α组裸鼠原位瘤体积(P<0.05);在SW1990细胞中,Vector组裸鼠原位瘤体积大小明显小于OE-HIF-2α组裸鼠原位瘤体积大小(P<0.05)。(2)si-Scramble组、si-HIF-2α组和Vector组、OE-HIF-2α组均未发现有肺转移情况;si-HIF-2α组有1例肠系膜转移结节;OE-HIF-2α组有1例出现肝转移合并肠系膜及皮下转移性结节,有1例单纯肝脏转移结节,有2例单纯肠系膜转移性结节,1例除胰腺原位瘤外未见其他部位转移。(3)si-Scramble组中有较典型的VM结构,而si-HIF-2α组中无明显VM结构的出现,差异有统计学意义(P<0.05);上调HIF-2α的OE-HIF-2α组有较多的VM典型结构,即CD34阴性且PAS阳性,而Vector组未见明显VM结构,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)Twist1和VE-cadherin在si-HIF-2α组的蛋白表达水平明显低于si-Scramble组,相同的,Twist1和VE-cadherin在OE-HIF-2α组的蛋白表达水平明显高于Vector组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论在体内实验中,HIF-2α可促进胰腺癌细胞VM的形成,并影响VM标志蛋白的表达,促进肿瘤的侵袭和转移。