多倍体化与基因工程相结合创造不育的英国梧桐新品系

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悬铃木作为优秀的行道树及园林树种,能适应城市环境和各种土壤条件,能吸收有害气体和吸滞粉尘,具有较强的抗空气污染,抗光化学烟雾、有害气体及良好的滞尘减噪、净化空气的能力。本实验研究了悬铃木属英国梧桐种的离体植株再生,多倍化和减数分裂基因OsPHS1的RNAi载体的遗传转化。 以英国梧桐种子为基础材料建立植株再生系统。结果表明,70%酒精处理40s,1‰的升汞处理40min,在不影响种子的萌发和将污染率降到最低的前提下,MS+6-BA<,6-7mg/L>+NAA<,0.2-0.3mg/L>为子叶诱导分化幼芽的最适培养基。MS+6-BA<,0.3mg/L>+NAA<,0.01mg/l>为丛芽扩繁的最适培养基。培养基中添加适量赤霉素(GA<,3>)对丛芽壮苗起到很好的促进作用。MS+6-BA<,1.5-2.0mg/L>+KT<,0.5mg/L>+IBA<,0.5mg/L>为叶片诱导分化芽的最适培养基,每个叶片平均的出芽为10-20个。蔗糖和大量元素(MS)的浓度分别为25g和2/3MS为解决丛芽叶片玻璃化的最适量。幼苗生根的最适培养基为1/2MS+NAA<,0.5mg/L>+6-BA<,0.1mg/L>。 本实验研究了秋水仙素不同浓度和处理时间对英国梧桐丛芽和叶盘的诱导效果。发现随着处理时间和浓度的增加,外植体的死亡率明显增加。多倍体细胞诱导率在一定范围内随处理时间和浓度增加升高,以0.06%的秋水仙素处理48h的丛芽多倍体细胞诱导率最佳,以0.05%的秋水仙素处理48h的叶片多倍体细胞诱导率最佳,且不对外植体产生严重伤害,获得的候选多倍体与正常二倍体相比,生长迟缓,气孔器变大,染色体加倍,因此将这些候选多倍体株初步鉴定为多倍体。 以英国梧桐试管苗叶片为试材,研究了卡那霉素(Kan)对离体叶片再生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素(Cef)对英国梧桐离体叶片再生的影响及对含有干涉减数分裂基因的农杆菌EHA105(pART27-dbphsl)的抑菌效果,确定了侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。结果表明,叶片外植体芽诱导的卡那霉素临界筛选质量浓度为5mg/L;叶片外植体芽诱导的头孢霉素临界除菌质量浓度为200mg/L。农杆菌菌株EHA105(pART27-dbphs1)菌液浓度为 OD<,595>=0.4-0.5,共培养培养基中乙酰丁香酮浓度为100μmol/L,感染时间为20min,共培养时间为3-4天。经过抗性植株的PCR检测获得了抗卡那霉素的阳性植株,初步证明外源基因OsPHS1已整合到英国梧桐基因组中。本实验建立的英国梧桐的遗传转化体系,为进行农杆菌介导目的基因培养悬铃木新品种奠定了理论基础并为培育不掉毛英国梧桐新品系打下了良好基础。
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