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C-反应蛋白(CRP)作为急性反应蛋白的主要蛋白,是一种针对疾病和监测治疗的很重要的标志物。CRP对疾病高度敏感,在疾病发生早期迅速上升,此标志物同样适用于犬类。建立一种方便快速、特异性强和灵敏度高的检测方法对于宠物犬的疾病防控和治疗具有重要意义。因此,本研究基于免疫学和层析技术原理的建立了犬CRP(CCRP)荧光定量免疫层析检测方法。本研究采用CCRP重组蛋白作为免疫原,经皮下多次免疫BALB/C小鼠,最终免疫后小鼠的抗血清效价可达到1:10~6;通过连续亚克隆和间接ELISA检测从87株杂交瘤细胞株中最终筛选出2株可稳定分泌抗CCRP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为2C5,2G8;经过小鼠腹腔内诱生产出腹水的效价均大于1:10~6;辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,经SDS-PAGE纯度鉴定显示所制备抗体与购买的阳性对照抗体无显著差异,经间接ELISA检测效价可达1:10~5;Western-blot结果显示,所制备的单抗与CCRP抗原有两条明显特异性结合带,特异性良好。本研究经优化成功制备了CCRP免疫荧光微球;荧光光谱仪分析荧光微球偶联抗体后荧光强度未有明显的降低,基本没有发生荧光猝灭;场发射扫描电镜(SEM)观察荧光微球偶联CCRP抗体后未发生团聚,形态比较稳定、均一;动态光散射(DLS)和Zeta电位对制备的CCRP免疫荧光微球的稳定性进行表征,结果表明在一定条件下CCRP免疫荧光微球的稳定性有所提高。最终优化的偶联活化时间为20 min,EDC和NHS使用量均为5 mg,CCRP抗体标记使用浓度为600μg/mL,偶联时间为2 h,MES缓冲体系pH=6.0。通过荧光免疫层析检测法筛选CCRP配对抗体,并且对试纸条的工艺条件进行优化,最终确定所构建试纸条参数:C线上鸡IgY的浓度为0.5 mg/mL,标记抗体与包被抗体距离为0.6 cm,T线上CCRP抗体浓度为2 mg/mL,T线和C线上抗体喷量为1.5μL/cm,包被膜干燥时间为48 h,CCRP免疫荧光微球稀释比例为15%,羊抗鸡IgY免疫荧光微球喷垫稀释比为1:200,CCRP标准品稀释比为1:200,免疫反应时间为180 s。开发的CCRP荧光定量免疫层析试剂盒进行性能评价和临床应用。结果表明:CCRP荧光定量免疫层析试剂盒的标准曲线y=0.909x~2-0.5441x+1.0839(R~2=0.9993),检测限为0.418 mg/L,检测范围为0.418-600 mg/L,标准曲线线性良好;在500 mg/L、250 mg/L、5 mg/L三个浓度点进行添加回收实验的平均回收率分别为100.21%、100.74%、99.79%,变异系数为0.60%、1.29%、5.46%,试纸卡准确性高;同时,批内变异系数为0.68%~6.92%,批间变异系数为0.89%~8.79%,试剂卡精密度较高;经干扰实验和试剂稳定性分析,试剂卡对胆红素、胆固醇、甘油三酯等9种干扰物无交叉反应,加速破坏后,T/C值无明显变化,试剂卡特异性和稳定性良好;自制CCRP荧光定量免疫层析试剂盒与商品化I-CHROMA试剂盒对临床样本进行对照检测,结果两者相关性和一致性良好。最终表明所开发的试剂盒可很好的应用于犬类疾病的预防与临床治疗监测。