干旱严重危害作物的生产。MYB转录因子在植物响应逆境胁迫包括干旱胁迫中起着重要调控作用。克隆抗旱相关的MYB转录因子,研究其在植物中的抗旱功能和作用机制,对植物抗旱育种具有重要意义。前期,本实验室从海岛棉中克隆了一个R2R3-MYB转录因子(GbMYB5),并通过遗传转化获得了过量表达GbMYB5基因的转基因普通烟草。为了进一步研究了GbMYB5基因在干旱胁迫中的功能,本研究通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)研究GbMYB5基因在棉花中的耐旱功能,并研究过量表达GbMYB5基因的转基因普通烟草对干旱胁迫的响应和耐旱功能,主要研究结果如下：VIGS沉默海岛棉GbMYB5后,对GbMYB5沉默植株(CLCrVA-GbMYB5)、野生型植株(WT)和注射空载体植株(CLCrVA)进行PEG模拟干旱和自然干旱研究其耐干旱功能。结果发现CLCrVA-GbMYB5植株、WT植株和CLCrVA植株浇灌10mL 18% PEG6000水溶液2d,恢复浇水一次后,CLCrVA-GbMYB5植株叶片严重萎焉,而WT植株和A植株叶片恢复正常。同样,CLCrVA-GbMYB5植株和CLCrVA对照植株自然干旱35d,然后恢复浇水一次,结果发现CLCrVA-GbMYB5植株叶片几乎掉落,茎失水萎缩,植株存活率约50%,而CLCrVA对照植株萎焉后恢复正常生长,存活率大约90%。VIGS结果表明抑制GbMYB5的表达量降低了棉花植株对干旱胁迫的抗性。利用半定量方法选择含有GbMYB5两株转基因烟草株系(TP1, TP2)研究GbMYB5基因的耐旱功能。首先,将3叶期幼苗根系切除后培养于含有2%PEG6000的1/2MS培养基,3周后,发现TP1、TP2的地下部分和地上部分都明显大于WT植株。其次,用25%PEG溶液浸泡转基因与非转基因野生型烟草(WT)叶盘7d,结果发现TP1、TP2叶盘仍保持绿色,而WT叶盘氧化严重呈焦黄色。再次,对TP1、TP2和WT烟草持续不浇水35d,再恢复浇水一次,结果发现大部分转基因烟草恢复正常生长,非转基因烟草萎焉严重甚至死亡,转基因烟草存活率为70%-80%,而非转基因烟草存活率只有30%。上述结果表明GbMYB5过量表达提高了转基因烟草耐旱性。正常生长条件下,取TP1、TP2和WT植株的倒一叶至倒三叶,室温条件下研究离体叶片失水率,结果表明TP1、TP2叶片失水率比WT低。取自然干旱处理7d前后的TP1、TP2和WT叶片检测植株的相对含水量,结果表明自然干旱处理前,TP1、TP2和WT的相对含水量没有显著差异,都在88-90%左右,自然干旱7d后,TP1和TP2含水量降至73-74%,而WT含水量则减少至66%,明显低于前者。观察叶片气孔发现转基因植株TP1与WT的气孔密度无明显差异,但TP1的气孔尺寸明显比WT小,TP1平均气孔大小为33.5×112.8μm,而WT平均气孔大小为38.2×120.6 μ,m,且在干旱胁迫条件下,TP1气孔张开率约45%,明显低于WT的90%气孔张开率。在正常生长条件下,抗氧化物酶POD和SOD的活性在TP1、TP2和WT间无明显差异,自然干旱处理7天后,TP1、 TP2和WT植株体内的POD和SOD活性都升高,但TP1、TP2植株的POD和SOD活性明显高于WT植株。荧光定量PCR检测抗旱相关基因的表达水平发现,在自然干旱7d后,TP1和TP2编码抗氧化物酶的基因(NtCAT、NtSOD、NtGST)参与多聚胺生物合成的基因(NtADC1、NtSAMDC)和编码LEA蛋白的基因(NtERD10D)表达水平明显高于WT植株。上述结果表明,在干旱胁迫的条件下,GbMYB5过量表达的转基因烟草通过降低叶片失水率提高了耐旱性,并通过提高体内抗氧化物酶的活性以及一些保护化合物(如多聚胺)和保护蛋白(如LEA蛋白)的含量,从而减轻干旱胁迫引发的活性氧、失水等对植物细胞的危害。将TP1、TP2和WT种子在含有0、1、3、6μmol ABA的1/2MS培养基上发芽进行ABA敏感性试验,结果发现GbMYB5基因过量表达提高了转基因烟草对ABA的敏感性。与WT植株相比,外源ABA显著抑制了TP1和TP2的发芽率,3 μM及以上浓度的ABA即可明显抑制GbMYB5转基因烟草种子的发芽率,表明GbMYB5基因可能参与ABA信号传导途径对干旱胁迫的响应。