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研究目的:临床上以骨关节病(osteoarthritis,OA)为代表的软骨缺损疾病较为常见,严重降低患者的生活质量。由于软骨基质中缺乏神经、血管而不能完全再生,因此在软骨缺损修复中,干细胞引导的组织再生引起越来越多的关注。牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)具有多向分化潜能,且较脐带沃顿间充质干细胞(WJCMSCs)与骨髓间充质干细胞(BMMSCs)相比具有更高的多向分化潜能。同时其来源广泛,不涉及伦理问题,可作为理想的种子细胞,但牙周膜干细胞分化机制尚不明确,限制了其在组织再生中的应用。在干细胞分化过程中,表观遗传学调控起到重要作用。KDM6A是主要的H3K27去甲基化酶,有研究证实,KDM6A与干细胞多向分化有关,KDM6A能促进间充质干细胞(MSCs)成骨分化,抑制其成脂分化,然而,KDM6A在干细胞成软骨分化中作用尚不明确。本课题旨在研究KDM6A对PDLSCs成软骨分化的影响,并探究其对软骨再生影响的机制,为牙源性干细胞介导的软骨组织再生奠定基础,促进牙源性干细胞在组织再生中的临床转化。研究内容:本课题探讨了KDM6A对PDLSCs成软骨分化潜能的影响及其作用机制,以及EZH2抑制剂对KDM6A敲低后PDLSCs成软骨分化能力影响的研究。研究方法:本实验收集因正畸治疗拔除的健康前磨牙和因阻生拔除的第三磨牙,采用酶消化法分离培养牙周膜干细胞,对体外培养的PDLSCs进行成软骨诱导分化,观察其成软骨分化能力。使用慢病毒转染的方法敲低KDM6A,RT-PCR检测敲低效率。对正常及敲低KDM6A后的PDLSCs进行成软骨分化诱导,于诱导2周时进行阿辛蓝染色及定量分析,并采用蛋白质印迹法对SOX9蛋白质表达水平进行检测。采用RT-PCR方法检测0天、3天、1周、2周和3周时成软骨相关分子SOX9、Col2a1、ACAN的表达,采用细胞爬片免疫荧光技术和蛋白质印迹法检测PDLSCs中H3K27me3及H3K4me3水平。使用EZH2抑制剂,观察敲低KDM6A后PDLSCs的成软骨分化能力及其组蛋白甲基化水平变化。使用SPSS16.0进行统计学分析,计量资料采用方差分析,P<0.05时表示差异有统计学意义。结果:敲低KDM6A对PDLSCs细胞增殖及凋亡无影响。敲低KDM6A能减少PDLSCs产生的蛋白多糖和胶原,并能减少SOX9的表达,而EZH2抑制剂(EPZ-6438)能拮抗敲低KDM6A对SOX9的抑制作用。敲低KDM6A后SOX9、Col2a1、ACAN表达水平均降低,而使用EPZ-6438后,PDLSCs-KDM6Ash组细胞中SOX9、Col2a1、ACAN的表达水平有所升高。KDM6A敲低后,PDLSCs中H3K4me3水平降低,H3K27me3水平升高,启动子区H3K27me3水平升高而H3K4me3水平降低;使用EPZ-6438后,与敲低KDM6A组相比H3K4me3水平升高,H3K27me3水平降低。结论:KDM6A在PDLSCs成软骨向分化过程中起正向调控作用,其机制可能是KDM6A影响成软骨分化相关基因的组蛋白甲基化水平,采用EZH2抑制剂可能挽救或部分挽救KDM6A敲低引起的组蛋白甲基化水平变化。提示过表达KDM6A或使用EZH2抑制剂在骨关节炎等软骨缺损疾病的治疗中可能具有价值。