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目的：采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-SpecificPolymerize Chain Reaction，MSPCR)检测不同子宫颈组织中p16基因甲基化的情况并结合免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)技术检测EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)和p16基因蛋白表达，分析EBV感染与子宫颈鳞状细胞癌(Cervical Squamous Cell Carcinoma,CSCC)的发病关系，探讨EBV的可能致癌机制，以期为CSCC的早期诊断和子宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)恶性潜能的评估提供线索和依据。
方法：
1．收集泸州医学院附属医院病理科2005年1月～11月存档的子宫颈病变的石蜡标本和相应的临床病理资料共82例，其中包括CSCC组织29例，CIN组织40例及正常子宫颈鳞状上皮组织13例。组织病理分级：CIN Ⅰ～Ⅱ级20例，CINⅢ级20例。临床分期(Clinical Staging，SC)按2002年国际妇产科联盟(Intemational Federation of Gynecology andObstetrics，FIGO)公布的新分期方法：Ⅰ期14例，Ⅱ、Ⅲ期15例。
2．构建组织芯片(Tissue Microarray)结合链霉亲和素—过氧化物酶染色法(Streptavidin Peroxydase Method，SP法)检测正常子宫颈鳞状上皮组织、CIN、CSCC组织中p16蛋白和EBV的表达情况(切片过程中CINⅢ级和CSCC Ⅱ、Ⅲ期组织各缺失1例，将缺失的病例从实验组中删除，实际入选病例为80例)。
3．以MSPCR技术扩增并鉴定p16基因甲基化的发生率。
4．实验结果应用SPSS 12.0 for windows软件包对实验数据进行统计学处理。采用四格表X2检验和Fishers精确概率法检验，以P＜0.05为有统计学意义。
结果：
1．正常子宫颈鳞状上皮组织、CIN和CSCC组织中，EBV蛋白阳性表达率分别为15.38％(2/13)、51.28％(20/39)、67.86％(19/28)，表达率呈递增趋势。其中正常子宫颈鳞状上皮组织与CIN比较差异有显著性(x2=5.147，P=0.023<0.05)；正常子宫颈鳞状上皮与CSCC比较差异有显著性(x2=9.784，P=0.002<0.05)；CIN组间、CSCC组织学分级及临床分期之间比较差异无显著性。
2．正常子宫颈鳞状上皮组织、CIN和CSCC中，p16蛋白阳性表达率分别为7.69％(1/13)、64.10％(25/39)、78.57％(22/28)，表达率呈递增趋势。其中正常子宫颈鳞状上皮组织与CIN比较差异有显著性(x2=12.41，P=0.000<0.05)；正常子宫颈鳞状上皮组织与CSCC比较差异有显著性(x2=18.11，P=0.000<0.05)；而CIN与CSCC比较差异无显著性(x2=1.629，P=0.202>0.05)。CIN Ⅰ～Ⅱ与CINⅢ级阳性表达率分别为45.00％(9/20)和84.21％(16/19)，两者比较差异有显著性(x2=6.510，P=0.011<0.05)；CSCC组织学分级及临床分期之间比较差异无显著性(P>0.05)。
3．p16-M和p16-U扩增的目标序列长度分别为150bp、151bp，产物经琼脂糖凝胶电泳(Agarose Gel Electrophoresis，AGE)分离后在DNA marker指示的相应位置上分别出现p16-M和p16-U两条明亮、边缘清晰的单一条带或只出现p16-M单一条带为阳性(+)结果，只有p16-U相应位置上出现清晰条带而p16-M相应位置没有或仅有非特异性条带者为阴性(-)结果。正常子宫颈鳞状上皮组织、CIN和CSCC组织中，p16 MSPCR阳性者分别为0.00％(0/13)、17.95％(7/39)、25.00％(7/28)，表达率呈递增趋势。正常子宫颈鳞状上皮组织与CSCC比较差异有显著性(x2=3.919，P=0.048<0.05)；CSCC组织学分级与临床分期之间比较差异无显著性(P>0.05)。
4．应用免疫组化检测80例子宫颈组织，EBV阳性表达41例，p16蛋白阳性表达48例：应用MSPCR方法检测p16基因甲基化14例阳性。41例EBV阳性表达的子宫颈组织中甲基化p16阳性8例，p16蛋白阳性26例；而EBV阴性39例中甲基化p16阳性6例，p16蛋白阳性22例。应用Fishers精确概率法检验p16基因甲基化在EBV阳性和阴性表达的病例中两组间的差异无显著性(P=0.771>0.05)，p16蛋白在EBV阳性和阴性表达的病例中两组间的差异无显著性(P=0.649>0.05)。
结论：
1．EBV表达增加随子宫颈病变恶性程度的增高而增加，与CSCC组织学分级及临床分期无关，提示EBV在CSCC的发生、发展过程中起一定的作用。
2．EBV在子宫颈鳞状细胞癌变的过程中可能不是导致p16基因甲基化的原因，p16基因甲基化是通过其它途径引发子宫颈鳞状细胞癌变。
3．p16蛋白表达缺失与CSCC无明显关系，相反其表达增加与之有密切关系，这表明在CSCC中，p16基因可能是一个具有抑癌和致癌双向作用的基因。
4．p16基因甲基化在CSCC中是频发事件，并且随着子宫颈病变恶性程度的增高而发生率升高，表明甲基化事件的发生在CSCC的发生、发展过程中起一定作用。