一.研究背景恶性肿瘤的治疗是当今生命科学和医学领域的难题。在妇女中高发病率的乳腺癌,是全球重要的健康问题,特别是在低收入和中等收入水平的国家更是如此。紫杉醇(Paclitaxel, PTX)是从短叶红豆杉的树皮中提取分离的抗肿瘤药物,是临床上治疗乳腺癌的有效抗癌药物。紫杉醇溶解度极低,因此,临床上将其溶解于聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇(50：50,v/v)中使用。然而聚氧乙烯蓖麻油在体内代谢释放的组织胺,会发生较严重的过敏反应。紫杉醇本身也因为缺乏对靶组织的选择性,所以有诸如骨髓抑制、血小板减少、白细胞减少、贫血等全身性毒副作用。聚氧乙烯蓖麻油代谢物产生的副作用和无选择性的全身毒副作用,大大限制了紫杉醇的临床应用。因此,利用载体包载紫杉醇是提高药效、减少毒害作用和提高生物利用度的有效途径与方法。液态氟碳纳米微球(perfluooctylbromide nanoparticles, NPs)是由脂质单分子层包裹液态氟碳(perfluooctylbromide, PFOB)组成。据报道NPs安全性好,作为血液代替品在临床使用。NPs作为新一代的纳米超声造影剂研究时,发现其作为药物载体同样具有优势。靶向性的纳米微球药物传递系统,是近年来兴起的技术,其作为药物传递系统的潜力近年来越来越受到重视。乳腺癌、卵巢癌等癌细胞比其它正常细胞表达产生的糖蛋白更高,硫酸脑苷脂(sulfatide)可以与细胞或细胞基质外的糖蛋白,特别是和肌糖蛋白(Tenascin-C, TN-C)相结合。因此,sulfatide可以作为靶向乳腺癌的靶向配体。本文将sulfatide和NPs连接起来作为PTX的给药系统(sulfatide-perfluooctylbromide nanoparticles,SNPs)靶向乳腺癌进行治疗。目前多数靶向型NPs都是以克隆抗体作为靶向材料,克隆抗体本身因为具有免疫原性、在体内稳定性差以及操作复杂等缺点,大大限制了靶向显像和给药的进一步发展。Sulfatide作为靶向材料,具有稳定性强,容易操作的优点。最重要的是它不仅可以作为靶向材料,而且在SNPs中还可以充当脂质外层膜的成分之一。靶向型NPs与细胞接触后,可以通过与细胞膜的磷脂双分子层进行磷脂交换,从而快速、有效地将更多包载在载体中的药物传递到细胞中。因此,SNPs作为靶向NPs的一种,可以通过更快捷的途径将更多的药物更高效率地传递进入靶细胞内。本文将SNPs作为PTX的靶向纳米传递载体,即含硫酸脑苷脂的靶向乳腺癌载紫杉醇液态氟碳纳米微球(Paclitaxel-sulfatide-perfluooctylbromide nanoparticles, PTX-SNPs)。SNPs具备以下两个优点：一是SNPs具有靶向乳腺癌的作用；二是SNPs与靶细胞接触后可以更高效率地将包载的药物传递到靶细胞中。因此,本文将PTX-SNPs作为PTX的靶向纳米载体进行表征、细胞毒性以及体内药效学等研究。二.研究方法第一部分：采用逆向蒸发方法成功制备PTX-SNPs。以载药量(Drug loading capacity, DLC)、包封率(Encapsulation efficiency, ELC)作为主要考察指标,通过单因素分析得出脂质的浓度(FactorA)、EPC和sulfatide的质量比(Factor B)、PFOB的含量(Factor C)和PTX的用量(Factor D)为主要影响因素,并通过四因素三水平的正交设计实验得出最佳处方,成功制备了PTX-SNPs,并对其进行表征和研究。第二部分：以小鼠乳腺癌细胞EMT6考察制剂对细胞的抑制作用,同时利用流式细胞术检测细胞凋亡情况。制备空白液态氟碳纳米微球(NPs)、含硫酸脑苷脂的空白液态氟碳纳米微球(SNPs).紫杉醇液态氟碳纳米微球(Paclitaxel-perfluooctylbromide nanoparticles, PTX-NPs)、含硫酸脑苷脂的紫杉醇液态氟碳纳米微球(PTX-SNPs)以及泰素(Taxol(?))。利用MTT和流式细胞术共同考察它们的细胞抑制作用。同时以香豆素6 (Coumarin 6)作为荧光探针,进行细胞吞噬荧光实验,验证处方对细胞的杀伤力强是由于该处方作用后的细胞内药物浓度相对较高。第三部分：大鼠尾静脉分别注射faxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs,给药量为PTX 10mg/kg。建立了高效液相(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析方法测定了大鼠血浆中PTX的浓度,并绘制血药浓度曲线,研究了Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs在大鼠体内的药动学参数。Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs在荷瘤小鼠各个组织中药物分布的测定,首先需要造模。将处于指数增长相的小鼠乳腺癌EMT6细胞进行肿瘤的接种。首先,将细胞胰蛋白酶消化并收集,用培养介质进行洗涤。然后采用血球计进行细胞计数,离心,移走上清液。用PBS重新混悬,离心,移走上清液。按照以上方法,用PBS清洗3遍,避免残留的FBS会引起小鼠免疫排斥。然后取0.2mL的注射用生理盐水将沉淀好的小鼠乳腺癌EMT6细胞以1.5×107的浓度注射在5周龄BALB/c小鼠右侧背部。2周后当小鼠背部肿瘤直径达到5-8mm左右,小鼠肿瘤总体积均匀长到约为200mm3时,造模成功。荷EMT6瘤小鼠于尾静脉注射Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs,给药剂量为10mg/kg。通过高效液相测定组织中药物浓度共同观测考察了Taxol(?)、PTX-NPs、PTX-SNPs在小鼠体内的组织分布。冰冻切片以Coumarin 6作为模型药物进行观测,将Coumarin 6、 Coumarin 6-SNPs和Coumarin 6-NPs于小鼠尾静脉注射,分别于1h和8h将小鼠处死,取出肿瘤组织浸在多聚甲醛中,注意避光保存,切片后荧光显微镜下检测。第四部分：建立小鼠乳腺癌模型,首先需要造模。造模方法同本文第三部分,造模成功后,分别于尾静脉注射生理盐水(对照)、空白的SNPs、Taxol(?)、 PTX-NPs和PTX-SNPs,每组给予相同PTX剂量10mg/kg。每4天注射1次,注射至第20天结束。每次注射前给小鼠称重,测量小鼠肿瘤体积并记录。第20天,处死小鼠,取出肿瘤组织称重,然后浸在多聚甲醛中,石蜡中包埋,最后切片进行免疫组化实验。通过绘制小鼠肿瘤组织体积增长曲线、计算各组指标的变化和进行肿瘤切片的TUNEL凋亡检测、新生血管密度(Microvessel density, MVD)和肿瘤坏死因子Bad等免疫组化实验,共同评价Taxol(?)、 PTX-NPs、PTX-SNPs对小鼠乳腺癌的治疗作用。三.实验结果1. PTX-SNPs的制备和评价采用旋转蒸发方法制备PTX-SNPs.以DLC、DLE和粒径作为主要考察指标,通过单因素分析计算,确定脂质的浓度(FactorA)、EPC和sulfatide的质量比(Factor B)、PFOB的含量(Factor C)和PTX的用量(Factor D)四个因素为主要影响因素,并通过四因素三水平的正交实验设计最终得出最佳处方为：脂质的浓度(FactorA)为1.2mg/mL、EPC和sulfatide的质量比40：1、PFOB的体积含量(Factor C)为15%,PTX的用量(因素A)为1.3mg/mL。经HPLC测定,优化处方后PTX-SNPs中PTX的ELC为96.20%±0.14%,DLC为1.24mg/mL。PTX-SNPs的粒径为237.5nm, Zeta电位为-14.7±0.7,多分散系数为0.28±0.045,马尔文测定粒径分布均匀。PTX-SNPs外观为具有蓝色乳光,电镜下观测PTX-SNPs为规则的球形或类球形,粒径与马尔文检测结果基本一致。通过HPLC测定Taxol(?)、PTX-NPs和PTX-SNPs的释放。透析14h时,Taxol(?)中PTX的释放率已经接近100%; PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的释放率分别为52.78%±1.29%和49.78%±1.28%。透析60h时,PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的释放率分别为87.44%±1.78%和80.80%±1.74%。PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的释放特点是最初爆发性释放,接着是持续、缓慢的释放。2. PTX-SNPs的细胞毒作用为了考察PTX-SNPs对小鼠乳腺癌EMT6细胞的细胞毒作用,采用MTT法测定比较几种制剂对小鼠乳腺癌EMT6细胞的细胞毒性作用。与PTX-SNPs作用后的EMT6小鼠乳腺癌细胞的活性低于游离PTX和PTX-NPs作用后的EMT6小鼠乳腺癌细胞的活性。在与PTX浓度为10μg/mL的PTX溶液、PTX-SNPs和PTX-NPs作用48h后的小鼠乳腺癌EMT6细胞早期凋亡率分别为3.9%±0.3%,4.6%±0.6%和13.6%±0.5%。当PTX浓度上升到30μg/mL时,早期凋亡率分别增长至13.1%±0.2%,13.3%±0.2%和44.9%±1.7%。我们由结果推测PTX-SNPs与小鼠乳腺癌EMT6细胞共同培养时,细胞中药物浓度分别高于与PTX-NPs和游离PTX共同作用的细胞内药物浓度。本文以Coumarin 6为模型药物,联合靶向阻断实验,验证该推测。结果显示与Coumarin 6-SNPs共同作用2h时,细胞内荧光强度分别是Coumarin 6-NPs和Coumarin 6组的1.9倍和2.0倍。与Coumarin 6-SNPs共同作用12h时,细胞内荧光强度的趋势和共同作用2h时趋势一致。3. PTX-SNPs在大鼠血浆中的浓度和小鼠组织中的分布Taxol(?)在大鼠血浆中的药物浓度在给药2h之内呈现快速消除相,在给药8h时血浆中已经检测不到PTX的浓度。PTX-SNPs和PTX-NPs在大鼠血浆中的药物浓度在给药2h之内也呈现一个快速的消除相,随后2-8h之间伴随相对缓慢的消除,8h以后到24h之间伴随速度非常缓慢的消除,血药浓度一直维持在较低的水平。PTX-SNPs和PTX-NPs给药后PTX在组织中的分布不同于Taxol(?),作为纳米制剂注射PTX-SNPs和PTX-NPs后,PTX在小鼠肝脏和脾脏的分布比注射Taxol(?)组在肝脏和脾脏的分布高。PTX-SNPs给药后,PTX在小鼠肿瘤组织的药物浓度明显大于PTX-NPs和Taxol(?)给药后的药物浓度。4.PTX-SNPs对荷EMT6乳腺癌小鼠的治疗作用PTX-SNPs、PTX-NPs和Taxol(?)治疗后的抑瘤率(Tumor inhibition ratio,TIR)分别为70.8%、45.6%和34.0%；体积双倍时间(Double time,DT)分别为(11.8±2.2)、(6.3±0.4)和(5.8±0.4)天。这说明PTX-SNPs对小鼠EMT6乳腺癌的治疗效果优于PTX-NPs和Taxol(?)的治疗效果。肿瘤增长曲线和第20天称重的肿瘤重量也和以上结果吻合。TUNEL肿瘤组织凋亡实验结果显示PTX-SNPs组凋亡率为46.83%±4.9%明显高于PTX-NPs(30.91％±3.52%)和Taxol(?)(24.27％±5.32％)等其他各组。同时免疫组化实验如MVD和Bad实验同样验证了PTX-SNPs可以通过促进肿瘤Bad的分泌和减少肿瘤MVD的生长,从而有效的促进乳腺癌组织细胞凋亡。四.研究结论本课题研究成功制备了PTX-SNPs靶向给药系统。外观有蓝色乳光,透射电镜下形态为球形或类球形。ELC为96.20%±0.14%,DLC为1.24mg/mL. PTX-SNPs的粒径为237.5nm,Zeta电位为-14.7±0.7,多分散系数为0.28±0.045,马尔文测定粒径分布均匀。肿瘤状态中的血管内皮间隙扩大,允许直径小于700nm的颗粒穿过。PTX-SNPs的粒径在200nm左右,为SNPs可以通过毛细管到达肿瘤细胞传递PTX提供了条件。PTX-SNPs外观具有蓝色乳光。体外模拟体内条件透析14h时,Taxol(?)中PTX的释放率已经接近100％;PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的释放率分别为52.78%±1.29%和49.78%±1.28%。透析60h时,PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的释放率分别为87.44%±1.78%和80.80％±1.74％。PTX-SNPs和PTX-NPs中PTX的释放特点是最初爆发性释放,接着是持续、缓慢的释放。在体外模拟环境中的释放相比较Taxol(?)具有延迟效果,推测是因为磷脂单层膜对药物释放起到阀门和控制膜的作用。通过测定和比较PTX-SNPs、PTX-NPs和Taxol(?)三种制剂对小鼠乳腺癌EMT6细胞活性的影响,结果表明PTX-SNPs比PTX-NPs和Taxol(?)对小鼠乳腺癌EMT6细胞具有更强的细胞毒作用。接着又通过早期凋亡率的测定验证了在共同作用48h时PTX-SNPs比PTX-NPs和Taxol(?)具有更强的促小鼠乳腺癌EMT6细胞凋亡的作用。以Coumarin 6作为模型药物,通过细胞摄取载体包载药物的实验,证实Coumarin 6-SNPs相比Coumarin 6-NPs和Coumarin 6,可以将更多的Coumarin 6传递到小鼠乳腺癌EMT6细胞中。靶细胞中药物浓度高,自然因为药物产生的杀伤力也更强。测定不同处方给药后PTX在大鼠体内的血药浓度曲线和小鼠体内的组织分布,PTX-SNPs已经改变了PTX的药动学行为和组织分布。PTX-SNPs在大鼠血浆中半衰期比Taxol(?)长,在小鼠体内EMT6肿瘤、肝脏和脾脏中分布较Taxol(?)多。靶部位药物浓度高,治疗作用强。因此,本文也开展了PTX-SNPs治疗荷EMT6乳腺癌小鼠的初步药效学研究。通过测量肿瘤体积、绘制体积-时间增长曲线,肿瘤称重计算的DT、TIR等指标,共同验证了PTX-SNPs在小鼠体内治疗EMT6乳腺癌的疗效远远优于PTX-NPs和Taxol(?)。TUNEL实验和免疫组化实验结果显示PTX-SNPs可以促进乳腺癌组织细胞凋亡和肿瘤坏死因子Bad的分泌,同时减少肿瘤MVD的生长。这些都有助于抑制肿瘤组织的生长和促进肿瘤细胞的死亡。对小鼠乳腺癌的治疗,PTX-SNPs强于PTX-NPs和Taxol(?)的治疗作用,主要得益于sulfatide对小鼠乳腺癌EMT6细胞或细胞外基质上的TN-C的靶向作用以及SNPs高效率地传递药物进入靶细胞的能力。