基于DNA循环放大的肿瘤标志物传感分析研究

来源 :青岛科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong587
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本论文的主要内容是将电化学分析技术、比色分析技术、化学发光分析技术、纳米技术、DNA杂交技术以及DNA循环放大技术相结合,研制出高灵敏度、高选择性的新型DNA生物传感器,对部分肿瘤标志物进行选择性的识别和测定,为肿瘤的临床早期诊断提供基础性研究资料。本文着重描述了三种类型的DNA生物传感器的研制以及其性质的研究:  1.研究了一种新颖且灵敏的将DNA材料和内切酶循环放大用于检测目标DNA的电化学生物传感器。工作原理如下:首先,为DNA传感器组装过程,将DNA骨架连接在磁珠上,这样就扩大了量子点修饰的DNA探针着位点。其次,为内切酶的循环放大过程,构建的DNA生物传感器经过内切酶的循环放大过程,进一步提高了DNA序列的检测灵敏度。最后,为电化学检测过程,加入PbS量子点参与反应,经硝酸处理过以后,Pb2+的浓度变化可通过溶出伏安电流强度的变化来确定,由于目标DNA的浓度与Pb2+的浓度在一定范围内成正比关系,从而实现对目标DNA的检测。在实验优化级选定的最佳条件下,得到了目标DNA的线性范围为2.0×10-16~1.0×10-15mol/L,检测限为1.2×10-16M。  2.在结合磁珠和酶循环放大的前期工作基础上,我们又研究了一种结合聚合酶循环放大、熵驱动过程和适体识别手段的ATP生物传感器。它用了比色检测手段对Ramos癌细胞中的ATP含量进行了检测。传感器工作原理如下:首先,构建熵驱动循环前体物。其次,加入燃料DNA、ATP适体DNA及聚合酶,构成了一个含有多个循环的反应体系。最后,加入标记了亲和素的辣根过氧化物酶(HRP),它跟含有生物素的燃料DNA结合,经磁珠分离后,HRP可催化OPDA-H2O2显色,形成的OPDA-H2O2-Avidin-HRP体系,产生的信号用紫外分光光度计检测。因为所测ATP的含量跟Avidin-HRP含量,即,OPDA-H2O2显色程度有关,并在一定范围内成一定比例关系,所以可用于检测ATP含量。在最佳实验条件下,对ATP进行了测定,检测限为6.1×10-10M。并且在此基础上,实现了癌细胞中ATP含量的检测。  3.在以上两种生物传感器的研究基础上,我们结合最新的文献报道探索了一种检测细胞的新方法,与前两种不同的是,这种新的检测方法的研究目的不再局限于DNA或生物大分子的识别和检测,它的主要用途是检测癌细胞。其检测原理是:首先,将底物DNA、Ramos癌细胞适体DNA分别固定在链酶亲和素包被板和磁珠上,杂交互补的DNA后,形成酶循环前体。其次,加入聚合酶、连接酶、dNTPs和环DNA后,构成了一种结合聚合酶和滚环复制过程循环放大的体系。最后,再加入氯化血红素(Hemin)反应后,形成的DNA酶可催化luminol-H2O2体系发光,可用微弱化学发光检测仪进行化学发光信号检测。在这个反应体系中,检测Ramos癌细胞浓度在一定范围内跟化学发光强度有一定关系。在最佳实验条件下,对Ramos癌细胞进行了测定,能检测到10个癌细胞。
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