论文部分内容阅读
植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害。该病广泛分布于全球的热带、亚热带和温带地区,并逐渐向高纬度、高海拔冷凉地区扩散蔓延。青枯菌寄主范围广泛,可侵染包括马铃薯、香蕉、烟草、番茄、生姜和桑树等重要粮食与经济作物在内的54个科的450余种植物,于世界范围内造成巨大的经济损失。由演化型I型桑菌株引起的桑青枯病（bacterial wilt of mulberry）是对桑蚕生产具有毁灭性危害的主要桑树病害之一。鉴于其重要的经济与学术研究价值,2012年青枯菌被《Molecular Plant Pathology》杂志列为10大植物病原细菌之一。国内外围绕青枯菌基因组学、系统进化、致病机理、检测方法以及防控技术等诸多领域展开了深入研究,相继有GMI1000、Po82、PS107、UY031等13个青枯菌株完成了全基因组序列的测定,CMR15、FQY4、B50等54个青枯菌株完成了基因组草图序列的测定。但是由于青枯菌群体复杂,具有广泛的生态适应性,栽培寄主抗病种质资源缺乏,尚无环保低毒、经济有效的化学杀菌剂,致使青枯病的防控成为难以突破的世界性瓶颈问题。建立精准、灵敏、高效的青枯菌种及种以下菌株水平上的分子检测技术,是有效阻断青枯病传播扩散,实现田间早期诊断并建立科学防控策略的基石;发掘植物源抑菌活性物质,研发新型生物农药不仅可为青枯病防控提供新的思路与技术储备,也有助于解决公众日益关切的食品安全、生态安全以及公共卫生安全问题。据此,本研究旨在:（1）建立青枯菌种及菌株分类单元水平上的特异性LAMP分子检测方法;（2）筛选对青枯菌具有抑制活性的植物精油,并评价抑菌效果,以期探寻新的青枯病防治方法。1.基于青枯菌特异性序列lpxC基因设计4条引物,建立青枯菌的LAMP快速检测方法,在1 h内获得可视化检测结果。通过单因素变化试验优化反应体系,确定反应体系中镁离子浓度为6 mmol/L,内外引物浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2μmol/L）,反应温度为63℃。在特异性测定试验中,24个青枯菌菌株反应液观察到荧光绿色的阳性反应,而对照菌株及阴性对照的反应液均保持橙色不变,表明该方法可特异性检测青枯菌。在灵敏度测定试验中,LAMP方法的检测灵敏度为1.42 pg,较常规PCR提高10倍。对人工接种和田间罹病样品进行检测,结果显示LAMP检测方法不受植物组织浸出液的干扰,可用于病株样品的检测。该方法特异性强、灵敏度高、操作简单、检测结果可用肉眼直接观察,为田间快速检测青枯菌提供新的方法。2.基于青枯菌演化型I型桑菌株的特异性核苷酸片段MG67设计了6条引物,建立了演化型I型桑菌株的LAMP快速分子检测方法,在20 min内获得可视化检测结果。通过ABI 7500Real Time PCR实时观测反应过程,确定最优反应温度为64℃,反应时间为20 min。在特异性测定试验中,23个青枯菌演化型I型桑菌株反应液观察到荧光绿色的阳性反应,23个非演化型I型桑菌株的青枯菌、7个对照菌株及阴性对照的反应液均保持橙色不变,表明该方法可特异性检测青枯菌演化型I型桑菌株。在灵敏度测定试验中,LAMP对基因组DNA的最低检测浓度为160 fg,较常规PCR提高10倍;LAMP对菌悬液的检测灵敏度为2.2×102 CFU/mL,且不受桑组织提取液的干扰,较常规PCR提高100倍。对田间收集桑植株样品进行检测,表明该方法可用于田间病株样品的检测,可为田间青枯菌演化型I型桑菌株的快速检测提供新的方法。3.采用抑菌圈及MIC值和MBC值的测定评价了4种植物精油对青枯菌的离体抑菌效果。抑菌圈测定结果显示,薄荷精油、草果精油、薰衣草精油和山苍子油对青枯菌Po82菌株均具有抑菌效果,其中山苍子油可完全抑菌;最小抑菌浓度MIC和最小杀菌浓度MBC测定结果显示,薄荷精油的MIC值和MBC值均为4μL/mL,草果精油的MIC值和MBC值分别为4μL/mL和8μL/mL,薰衣草精油的MIC值和MBC值均为4μL/mL,山苍子精油的MIC值和MBC值均为1μL/mL,山苍子油的抑菌效果最好。4种精油对青枯菌作用方式多样,精油挥发性气体抑菌效果测定结果显示,薄荷精油、草果精油、薰衣草精油和山苍子油的抑菌圈分别为7.80±0.037 mm、8.50±0.057 mm、13.10±0.122 mm和19.00±0.181 mm,对青枯菌Po82菌株均具有抑制作用。4.利用气相色谱-质谱联用技术初步鉴定出了所用山苍子油中的主要化学成分,并通过对含山苍子油的培养基中青枯菌生长情况及山苍子油熏蒸效果的测定,评价了山苍子油对青枯菌的抑菌效果及作用方式。气相色谱-质谱联用技术鉴定结果表明,所用山苍子油中有不同化学成分29种,其中烯烃类化合物是主要成分,约占总量的40%。生长曲线测定结果显示,不同浓度的山苍子油处理对青枯菌的生长均具有不同程度的抑制作用;随着精油浓度的升高,抑制作用增强;浓度为1.6μL/mL的山苍子油处理后,青枯菌的生长受到完全抑制。利用不同体积的山苍子油对200 mL三角瓶中的带菌培养基进行熏蒸处理,山苍子油的熏蒸浓度分别为1、0.75、0.5、0.25、0.125和0.0625μL/mL,培养40 h后A600值分别为0.0332±0.0069、0.0540±0.0183、0.0619±0.0069、0.0981±0.0746、1.3744±0.0164和1.7317±0.0466,与空白对照差异极显著,表明山苍子油通过熏蒸对青枯菌表现出明显的抑制作用。带菌土壤通过山苍子油熏蒸处理3 d后,可有效降低青枯病的发病指数,山苍子油浓度分别为0.10-0.50μL/mL时,移栽番茄苗8 d后病情指数降低36-78%。表明山苍子油可作为一种熏蒸剂,用于土壤中青枯菌的熏蒸处理。