临床上常用随意型皮瓣来覆盖各种外伤、溃疡、先天性畸形和肿瘤切除的创面和重建其结构。但是，由于随意型皮瓣缺乏知名血管，其存活主要依赖蒂部的血管网十分有限的供血和供氧，因此皮瓣的远端部分经常出现缺血甚至坏死。若能增加随意型皮瓣远端的缺血耐受能力，减少可能发生的缺血性坏死，无疑将具有重要的临床应用价值。　　及时形成新生血管，恢复灌注对缺血皮瓣组织的存活与否起着至关重要的作用。血管内皮生长因子(VEGF)是一种强大的促血管新生因子，它能促进血管内皮细胞有丝分裂，增加内皮细胞渗透性和促进血管生成，进而起到促进组织愈合的作用。同样，血红素加氧酶-1(HO-1)作为降解血红素产生一氧化碳、铁和胆绿素的关键限速酶，也能减少骨骼肌的缺血坏死。但外源性VEGF和HO-1存在半衰期短、容易降解以及安全性等问题。如果在皮瓣缺血前即能诱导VEGF和HO-1表达，促进新生血管形成将有助于提高随意型皮瓣的存活。　　近年来，我们和其他的研究小组发现除了低氧以外，吸入麻醉药异氟烷的能调控低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达以及靶基因的转录。而已知VEGF、HO-1都是HIF-1α下游靶基因，且都部分参与了对皮瓣缺血损伤的保护效应，因此我们推测:吸入麻醉药异氟烷预处理可能对缺血皮瓣组织具有一定的保护效应，并且很可能是通过HIF-1α系统表达上调来实现的。　　本次实验中，我们将分别从离体和在体实验全面研究吸入麻醉药异氟烷预处理是否能增加超长宽比随意型皮瓣的存活，并且通过基于慢病毒转染的RNAi技术来明确HIF-1α在其中的地位。本课题研究共分为以下三个部分:　　第一部分大鼠HIF-1α序列的设计和siRNA慢病毒载体的构建　　目的:构建能有效抑制大鼠皮肤成纤维细胞HIF-1α基因表达的RNAi慢病毒载体(Lentivirus-HIF-1α-siRNA)，为后期研究HIF-1α蛋白在异氟烷预处理对缺血皮瓣保护作用中的地位奠定基础。　　方法:设计针对大鼠HIF-1α基因的RNAi序列，在此基础上构建能有效抑制大鼠HIF-1α基因表达的lentivirus-HIF-1α-siRNA。转染大鼠皮肤成纤维细胞后通过qRT-PCR和westernblot进行鉴定。　　结果:成功构建了HIF-1α-siRNA质粒并进行了慢病毒包装，得到了滴度为109TU/ml的lentivirus-HIF-1α-siRNA。最后经qRT-PCR和westemblot进行鉴定证实lentivirus-HIF-1α-siRNA对HIF-1α基因的干扰效率为85％。　　结论:构建HIF-1α靶向siRNA重组表达载体能有效抑制大鼠皮肤成纤维细胞HIF-1α基因的表达，因此可用于后续研究。　　第二部分异氟烷诱导HUVECs和人皮肤成纤维细胞HIF-1α表达上调及机制研究　　目的:以人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)和人皮肤成纤维细胞株为研究对象，探讨吸入麻醉药异氟烷预处理是否能诱导HIF-1α及其下游靶基因的表达，并深入分析可能的信号机制。　　方法:qRT-PCR、ELISA和westernblot检测不同浓度异氟烷预处理或异氟烷处理后不同时间点HIF-1α、VEGF和HO-1表达情况。westernblot检测异氟烷和缺氧对细胞HIF-1α表达的影响。通过加入CHX阻断蛋白质合成检测HIF-1α蛋白半衰期，并以TGF-1β、DMOG和常氧为阳性或阴性对照，明确异氟烷对HIF-1α蛋白稳定性的影响。通过给予PI3K抑制剂、GSK3β抑制剂和mTOR抑制剂，来深入分析可能的信号转导机制。　　结果:异氟烷预处理HUVECs和人皮肤成纤维细胞可诱导HIF-1α及其下游靶基因VEGF和HO-1蛋白的表达。异氟烷预处理HUVECs能在一定程度上增加HIF-1α蛋白的稳定性。PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-GSK3β信号通路共同参与了异氟烷预处理诱导HUVECs表达HIF-1α的过程。　　结论:异氟烷预处理通过PI3K/Akt-mTOR和PI3K/Akt-GSK3β信号通路增加了HIF-1α蛋白的表达和稳定。　　第三部分异氟烷预处理促进超长宽比随意型皮瓣存活的在体研究　　目的:通过动物实验来明确异氟烷预处理是否能增加超长宽比随意皮瓣的存活，并且运用lentivirus-HIF-1α-siRNA来明确HIF-1α在其中的地位。　　方法:取雄性SD大鼠40只，随机分为CON、ISO、Neg-siR、HIF-siR和DMOG组(n=8)。CON组:仅接受标准的超长宽比随意型皮瓣手术（阴性对照）;ISO、Neg-siR和HIF-siR组:在1.5％异氟烷预处理前48h分别予背部局部注射PBS、scrambledsiRNA和HIF-1αsiRNA。1.5％异氟烷预处理后24h再接受标准的超长宽比随意型皮瓣手术;DMOG组:在术前48h、术中和术后24h分别腹腔注射DMOG（阳性对照）。在术后7天行皮瓣存活率检测和全景激光灌注成像检测(FLPI)。术后第十天行皮瓣组织学检测。　　结果:局部注射lentivirus-HIF-1α-siRNA能有效抑制HIF-1α及下游基因VEGF的表达。异氟烷预处理显著增加了皮瓣的存活率、血流灌注和新生血管形成，此作用能被基于慢病毒的siRNA所阻断。　　结论:异氟烷预处理显著增加了大鼠背部随意型皮瓣的存活率和皮瓣组织的新生血管化，此作用可能与HIF-1α系统表达上调有关。