糖蛋白具有重要的生理和生化作用,但以目前的技术获得均一糖蛋白很困难,因此对其结构和功能的研究非常缓慢。体外糖链人源化的改造主要是利用酶的合成活性进行糖肽的定向合成,将完整的N-糖苷直接连到肽链的糖基化位点上。因糖苷不易以化学方法或者酶法大量合成,因此从自然界中分离天然的N-糖苷便成为获得N-糖苷的最有效的方式。本实验从鸡蛋蛋黄中分离到复杂型N-糖苷,并尝试了两种酶法合成糖肽。鸡蛋蛋黄中富含复杂型的N-唾液酸寡糖,可为糖肽的体外合成提供丰富的N-糖苷来源,并且鸡蛋中含有的N-糖苷与人体内N-糖苷极其相似,因此获得鸡蛋蛋黄中的N-糖苷具有重要的意义。本实验改进了Akira Seko等人提出的分离方法,大大缩短了分离时间,提高了分离效率。按照Akira Seko的方法,从100个鸡蛋蛋黄中分离得到糖肽SGP大约需要五个半月的时间,用改进法1纯化,大约需要四个半月的时间,而使用改进法2大约只需两个月的时间。从100个鸡蛋中,用Akira Seko的方法大约得到240mg SGP和12mg寡糖苷FSG,用改进法1大约得到300mg SGP,15mg FSG,用改进法2大约得到340mg SGP。利用改进法2纯化SGP,纯化效率提高了41%,纯化时间仅为原来的45%,并且节约了试验试剂等费用,为大量生产糖苷或者糖肽奠定了试验基础。SG是只带有Asn的复杂型寡糖,相比带有6个氨基酸的SGP来说,更容易用化学法保护、修饰,保护修饰后的SG可作为底物,以固相合成法合成具有所需肽链序列的糖肽。1mg SGP经pronase酶切、Graphic Carbon纯化后可得到0.73mg SG,纯化效率可达到80%。SG的市场价格大约为RMB 20000/mg。蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶在一定的条件下具有逆反应活性,可以形成酰胺键合成肽链。基于催化中心和正反应催化机理的相似性,本实验探索了来源于酿酒酵母的糖酰胺酶(Pnglp)是否具有逆反应活性,即合成糖酰胺键形成糖肽。合成的促红细胞生成素糖基化位点八肽(底物)在2h后开始逐渐丢掉Asp的γ位羧基的保护甲基,在4h后,一半的八肽都失去了甲基。如果Asp的γ位羧基失去了保护甲基,由甲酯变成了羧基,则失去了作为Pnglp合成糖肽的底物的活性。因此,合成糖肽的反应时间应该少于4h。丙酮浓度大于8%时,Pnglp的酶切活性显著降低,超过10%则失去了酶切活性,因此选用8%的丙酮作为提高反应速率的有机溶剂。在8%丙酮存在的条件下,检测不同时间Pnglp的酶切活性,发现2h之内均有活性。综合以上优化条件,最终选取8%丙酮和2h,作为检测酶法合成糖肽的条件。经LC-MS检测,并未检测到可利用Pnglp逆反应合成的糖肽。实验证明在大肠杆菌中重组表达来源于拟南芥的AtPnglp,该酶表现为转谷氨酰胺酶活性,而作为糖酰胺酶活性很低。Andreas Diepold等人证明AtPnglp在酿酒酵母中重组表达为糖酰胺酶活性,而不具有转谷氨酰胺酶活性。结合上述两种结果可以得出结论:AtPnglp在不同的微生物中重组表达,表现出不同的活性;在原核生物大肠杆菌中表达,该酶表现出转谷氨酰胺酶活性,而在真核生物酿酒酵母中则表现出糖酰胺酶活性。推测很有可能是在真核生物中表达的酶被糖基化而表现出糖酰胺酶活性,在原核生物中表达的酶未被糖基化而表现出转谷氨酰胺酶活性。在AtPnglp合成糖肽的试验中,虽然用HPLC检测到了新峰的生成,但在新峰处用LC-MS并未检测到新合成糖肽对应的分子量。这可能与该酶对底物的结构偏好性有关,或者与检测手段有关。