一、研究背景:从20世纪80年代开始,Raf激酶家族（A-Raf基因、B-RAF基因和C-Raf/Raf-1基因）被确认为逆转录病毒致癌基因,并一直在被研究中,它通过MAPK信号通路把信号转导到RAS的下游,从而控制了细胞的生长、存活和转化等生物特性。A-Raf基因、B-RAF基因和C-Raf/Raf-1基因共同构成丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,参与RAS-RAF-MEK-ERK信号通路的传递过程,这一级联反应参与调控多种效应,包括细胞的凋亡、周期进展、分化、增殖和癌变等。三者中,A-Raf的激酶生物活性最低,活性最高时也仅仅为C-Raf的激酶生物活性的20%左右,B-Raf的激酶生物活性最强。Raf激酶家族中三个成员的功能既彼此交叉又有着高度独立性,不同的上游信号分子可以激活不同的Raf蛋白,其下游信号也转导不同的过程。然而部分肿瘤中Raf激酶家族成员的突变率很低,或在其突变率高的肿瘤中Raf激酶家族成员为野生型时,Raf激酶家族成员的表达与肿瘤患者的预后以及肿瘤微环境等之间关系整体性的研究很少。因此,本研究基于TCGA数据库大规模转录组学数据,泛癌中探讨Raf激酶家族基因的表达与肿瘤基质、免疫评分、RNA干性评分（RNA stemness score,RNAss）、DNA干性评分（DNA stemness score,DNAss）、微卫星不稳定性（microsatellite instability,MSI）、肿瘤突变负荷（Tumor mutational burden,TMB）以及药物敏感性的相关性,阐明Raf激酶家族基因在癌症进展中所起的作用,为进一步研究Raf激酶家族成员作为肿瘤治疗靶点以及预后标志物提供见解。结肠癌（Colon adenocarcinoma,COAD）是一种分子异质性疾病,结肠癌病人的诊断一直是临床医师和病人所面对的主要挑战,由于对COAD病人的多数诊断都是晚期,表现为深肠壁侵犯或远处转移,并且病人的预后差和五年内生存率低。因此寻找早期的诊断标志和预后标志是非常有必要的。在人类晚期结肠癌研究中观察到,BRAF突变主要出现在百分之八-百分之十二的病例中,而第15外显子中的T1799A点突变导致缬氨酸被谷氨酸取代,即V600E,是最常见的突变。基于BRAF靶标的BRAF抑制剂已经成为研发热门,到目前为止,尚不清楚BRAF-V600E突变在结肠癌免疫微环境中的作用及其机制。本文中采用的大规模转录组学方法旨在研究BRAF-V600E突变结肠癌与非BRAF-V600E突变结肠癌中免疫浸润细胞的区别,以及BRAF-V600E突变对结肠癌免疫微环境的影响及其机理,为研究BRAF-V600E结肠癌的生物学机理和免疫学诊断带来某些有益的帮助。生物标志物是早期发现、预测生存和预后以及评估治疗反应的关键工具。有用的生物标志物可以辅助临床治疗决策,提高患者的存活率和生活质量。随着组学技术的发展,许多潜在的指示基因被筛选用于各种疾病,这些基因被广泛用于肿瘤发生的辅助诊断。结肠腺癌是世界上最常见的癌症类型之一,发病率居世界第三,死亡率居世界第二。COAD的初期通常无明显临床症状。此外,缺乏有效的敏感性和特异性高的筛查或诊断指标,往往导致错过治疗机会。胶原三股螺旋重叠蛋白1（Collagen triple helix repeat containing 1,CTHRC1）是组织修复过程中分泌的糖基化蛋白,其功能是减少胶原基质的沉积,从而促进细胞迁移。生理条件下,CTHRC1的正常表达可以促使创伤愈合。但是,CTHRC1的过表达促使了肿瘤细胞的增殖和侵袭。研究还证实,CTHRC1可以通过Wnt/PCP信号通路促进结肠癌细胞的增殖。在人类肝细胞癌中,通过抑制CTHRC1的表达能够抑制整合素β,进而抑制肿瘤细胞转化和侵袭,从而诱发细胞凋亡。总之,CTHRC1的促瘤机制涉及多个靶点。本研究除了揭示CTHRC1在COAD发生发展中的分子机制,还评估了CTHRC1作为COAD早期诊断和预后生存生物标志物的应用潜力,为结肠癌新的治疗方式提出了全新的思考。二、研究目的1、探讨泛癌中Raf激酶家族成员泛癌中的表达以及对患者预后以及肿瘤微环境的影响。2、探讨BRAF-V600E与结肠癌各临床病理特征关系,BRAF-V600E结肠癌和非BRAF-V600E结肠癌组织中免疫浸润细胞的差异,BRAF-V600E突变对结肠癌免疫微环境的影响以及其机制。3、寻找结肠癌患者早期的诊断标志以及预后标志。三、材料与方法1、从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库下载Raf激酶家族成员泛癌中患者的基因组、转录组以及临床数据。2、利用单变量COX风险比例回归模型和KM（Kaplan-Meier）曲线方法分析病人存活状况,ESTIMATE算法计算癌症基质和免疫评分,获取RNA干性评分和DNA干性评分,评估病人微卫星不稳定性和肿瘤突变负荷状态。将Raf激酶家族成员表达水平与上述指标进行相关分析。3、从TCGA和基因表达综合数据库（Gene expression Omnibus,GEO）数据库下载BRAF-V600E突变结肠癌患者相关的转录组数据以及有关临床数据。4、比较BRAF-V600E突变结肠癌和非BRAF-V600E突变结肠癌免疫细胞浸润差异。BRAF-V600E突变结肠癌与非BRAF-V600E突变结肠癌差异表达基因的本体论分析和基因组富集分析。5、BRAF-V600E突变结肠癌与非BRAF-V600E突变结肠癌组织中各免疫检查点的表达差异。6、利用各种肿瘤数据库从m RNA和蛋白水平研究CTHRC1在COAD中的表达。此外,CTHRC1的表达与不良预后显著相关。四、研究结果1、分析TCGA数据库中的33种恶性肿瘤细胞与癌旁组织中Raf激酶族成员之间的m RNA差异及表达水平,多种肿瘤中A-Raf基因、B-Raf基因、Raf-1基因癌细胞系和癌组织中的表达与正常细胞系以及癌旁组织相比有差异,存在显著的肿瘤间异质性。2、使用单变量COX风险比例回归模型,分析Raf激酶家族基因表达对癌症患者的预后影响发现,不同Raf激酶家族成员在癌症中起不同的预后作用。3、Raf激酶家族成员表达影响着癌症的肿瘤微环境,与患者的肿瘤基质评分与免疫评分有关。4、Raf激酶家族成员的表达与患者的TMB和MSI有关。5、BRAF-V600E突变结肠癌与非BRAF-V600E突变结肠癌组织中部分免疫细胞的浸润具有差异。基于6种算法计算可知,BRAF-V600E突变结肠癌与非BRAF-V600E突变结肠癌中CD8+T细胞,中性粒细胞,NK细胞,M1型巨噬细胞的浸润存在显著差异。6、BRAF-V600E突变结肠癌与非BRAF-V600E突变结肠癌多种免疫检查点的表达有差异。7、CTHRC1在结肠癌中的m RNA以及蛋白表达水平均比正常组织高。并且CTHRC1在COAD早期高表达并且与结肠癌患者的不良预后有关。五、结论1、在不同肿瘤类型之间以及在每种肿瘤类型内的不同RAF激酶家族成员的表达存在内在差异,进而促进或抑制肿瘤的发生,如Raf1在大部分癌症类型中的表达水平均相对较低。表明需要将Raf激酶家族成员作为个体进行研究;2、Raf激酶家族在泛癌中的预后作用为Raf激酶家族基因在肿瘤学中的应用以及成为肿瘤预后标志物提供见解,从而有助于患者通过结合检测Raf激酶家族基因的表达能更有效的预测患者预后;3、Raf激酶家族表达水平可以作为癌症患者用药后免疫治疗评估的额外指标;4、BRAF-V600E突变与结肠癌的恶性程度有关,BRAF-V600E不仅通过影响T细胞来操纵抗肿瘤免疫应答,而且在不同的肿瘤类型之间可能有所不同。此外,Braf可能与其他免疫检查点成员协同作用,以调节结肠癌的免疫微环境。5、CTHRC1是一种潜在的COAD诊断和预后的生物标志物。