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[背景] 恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病和多发病。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族的发现及其对肿瘤细胞的杀伤作用,为肿瘤的防治提供了有效方法。肿瘤坏死因子样弱凋亡因子(TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是1997年由Chicheportiche等发现的一种新的TNF超家族成员,按发现时间次序被命名为肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12),它是一种Ⅱ型跨膜蛋白。研究表明,TWEAK的组织表达分布较广泛,具有多种生物学功能,包括诱导细胞凋亡,参与炎症反应,调节免疫,调节血管内皮细胞的生成和增生等。昆虫中表达的重组可溶性TWEAK在INF-γ的协同下,可诱导人结肠腺癌细胞HT-29、胃癌细胞KATO-Ⅲ、口腔鳞癌细胞HSC3凋亡。而在HEK293细胞中表达的重组可溶性TWEAK能杀伤颈部横纹肌肉瘤细胞Kym-1。TWEAK引起细胞凋亡的信号转导途径目前不很清楚。Marsters等研究发现,它可与死亡受体DR3(TNFRSF12)结合,引起细胞凋亡和激活核因子NF-κB,并与TNF有重叠的信号转导通路。新近研究认为,TWEAK作用的细胞膜受体是成纤维细胞生长因子诱导剂14(Fn14),但引起不同细胞死亡的途径不同,有caspase依赖的细胞凋亡,组织蛋白酶B依赖的细胞死亡,或内源性TNF-α介导的细胞死亡。本研究是课题组对TNF-α、TRAIL等研究的基础上,在国内首先系统地对TWEAK的克隆、表达和生物学作用进行研究。 [目的] (1)从中国人组织细胞中克隆TWEAK cDNA的全长序列和可溶性胞外区编码基因sTWEAK1和sTWEAK2(sTWEAK1为TWEAK的150~767bp,而sTWEAK2为TWEAK的144~767bp);(2)将TWEAK胞外区编码基因在大肠杆菌中进行融合表达,并对表达产物进行初步纯化;(3)研究融合蛋白的细胞凋亡作用及其可能的作用机制;(4)构建TWEAK腺病毒表达载体,在HEK293细胞中进行表达,并评价TWEAK基因治疗恶性肿瘤的可能性。l方法l(1)本研究用RT一PCR方法,从人组织细胞总RNA中扩增可溶性TWEAK胞外区(STWEAKI和sTWEAKZ)的cDNA序列及全长编码序列,用琼脂糖凝胶电泳分析PcR产物,胶回收目的基因片段,连接到pMD 18一T克隆载体中,转化大肠杆菌K802,PCR和酶切筛选阳性克隆,全自动DNA测序验证序列;(2)sTWEAKI和sTWEAKZ分别亚克隆到pproEx HTb和pMAL一CZx表达载体中,分别转化大肠杆菌BL21和TBI,PCR筛选和酶切鉴定,阳性克隆用IPTG诱导表达,表达产物用SDS一PAGE分析和W七stem blot验证融合蛋白;(3)用NTA一1 SPin试剂盒初步分离纯化sTwEAKI融合蛋白;(4)用体外培养的肿瘤细胞和正常对表达产物进行活性检测,贴壁细胞用结晶紫染色法,悬浮细胞用磺酞罗丹明B染色法,酶标仪检测OD值;(5)敏感细胞用ELISA法检测细胞培养上清中IL一8的含量;(6)用光镜和电镜观察敏感细胞死亡和细胞凋亡情况;(7)用流式细胞仪分析表达产物对敏感细胞凋亡率和细胞周期的影响;(8)用双荧光素酶报告基因检测法,测定表达产物对敏感细胞NF一沼的影响;(9)用pshuttie穿梭质粒将TwEAK重组到腺病毒载体上,用脂质体转染法转染HEK293细胞,PCR鉴定重组质粒。I结果】(1)成功地从中国人肝癌组织和心肌组织中克隆了可溶性TWEAK胞外区sTWEAKI和sTWEAKZ,从正常人脾脏组织中克隆了TWEAK基因,测序结果与文献一致; (2)6一his一sTWEAKI融合蛋白在BLZI菌中获得高效表达。SDS一PAGE测定分子量约为30kDa,与预期大小一致。W七stem blot结果表明,融合蛋白能与兔抗人TWEAK多克隆抗体特异性结合。超声破菌后SDS一PAGE分析表明,上清中有可溶性6his一sTWEAKI融合蛋白,纯化效果较好,纯度约90%。细胞活性检测结果表明,6his一sTwEAKI融合蛋白7一567林g/m1浓度范围内对M85、LOVO、1990、SMMC7721、Hela、L929等细胞有不同程度的杀伤作用。ELIsA检测结果表明,它能刺激1 990细胞分泌IL一8增多。细胞HE染色光镜下观察,测活细胞变圆,变小,数量明显减少。透射电镜观察1990细胞出现典型的凋亡小体,细胞核染色质浓缩,边集,胞浆膜出现空泡。流式细胞仪检测发现,1990和M85细胞的凋亡率明显增高。核转录因子研究结果表明,6his一sTWEAKI可激活LOVO和1990细胞的NF一KB; (3)MBP一sTWEAKZ融合蛋白在TBI菌中也有可溶性表达产物。SDS一PAGE测定分子量约为63kDa,与预期大小一致。表达产物对M85、LOVO、1990细胞有一定的杀伤作用。但表达量和细胞活性均较低; (4)成功地构建了重组TWEAK一腺病毒载体,获得了重组腺病毒。l结论l (1) TWEAK胞外区在大肠杆菌中获得较高的可溶性融合表达; (2)TWEAK胞外区融合蛋白具有明显的生物学活性。可诱导多种肿瘤细胞凋亡。刺激敏感细胞IL一8分泌增多; (3)引起细胞凋亡的作用机制与激活NF一沼有关; (4)获得了重组TWEAK腺病毒,其功能有待研究。