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[背景] 恶性肿瘤是严重危害人类健康的常见病和多发病。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族的发现及其对肿瘤细胞的杀伤作用，为肿瘤的防治提供了有效方法。肿瘤坏死因子样弱凋亡因子(TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是1997年由Chicheportiche等发现的一种新的TNF超家族成员，按发现时间次序被命名为肿瘤坏死因子配体超家族成员12(TNFSF12)，它是一种Ⅱ型跨膜蛋白。研究表明，TWEAK的组织表达分布较广泛，具有多种生物学功能，包括诱导细胞凋亡，参与炎症反应，调节免疫，调节血管内皮细胞的生成和增生等。昆虫中表达的重组可溶性TWEAK在INF-γ的协同下，可诱导人结肠腺癌细胞HT-29、胃癌细胞KATO-Ⅲ、口腔鳞癌细胞HSC3凋亡。而在HEK293细胞中表达的重组可溶性TWEAK能杀伤颈部横纹肌肉瘤细胞Kym-1。TWEAK引起细胞凋亡的信号转导途径目前不很清楚。Marsters等研究发现，它可与死亡受体DR3(TNFRSF12)结合，引起细胞凋亡和激活核因子NF-κB，并与TNF有重叠的信号转导通路。新近研究认为，TWEAK作用的细胞膜受体是成纤维细胞生长因子诱导剂14(Fn14)，但引起不同细胞死亡的途径不同，有caspase依赖的细胞凋亡，组织蛋白酶B依赖的细胞死亡，或内源性TNF-α介导的细胞死亡。本研究是课题组对TNF-α、TRAIL等研究的基础上，在国内首先系统地对TWEAK的克隆、表达和生物学作用进行研究。 [目的] (1)从中国人组织细胞中克隆TWEAK cDNA的全长序列和可溶性胞外区编码基因sTWEAK1和sTWEAK2(sTWEAK1为TWEAK的150～767bp，而sTWEAK2为TWEAK的144～767bp)；(2)将TWEAK胞外区编码基因在大肠杆菌中进行融合表达，并对表达产物进行初步纯化;(3)研究融合蛋白的细胞凋亡作用及其可能的作用机制;(4)构建TWEAK腺病毒表达载体，在HEK293细胞中进行表达，并评价TWEAK基因治疗恶性肿瘤的可能性。l方法l(1)本研究用RT一PCR方法，从人组织细胞总RNA中扩增可溶性TWEAK胞外区(STWEAKI和sTWEAKZ)的cDNA序列及全长编码序列，用琼脂糖凝胶电泳分析PcR产物，胶回收目的基因片段，连接到pMD 18一T克隆载体中，转化大肠杆菌K802，PCR和酶切筛选阳性克隆，全自动DNA测序验证序列;(2)sTWEAKI和sTWEAKZ分别亚克隆到pproEx HTb和pMAL一CZx表达载体中，分别转化大肠杆菌BL21和TBI，PCR筛选和酶切鉴定，阳性克隆用IPTG诱导表达，表达产物用SDS一PAGE分析和W七stem blot验证融合蛋白;(3)用NTA一1 SPin试剂盒初步分离纯化sTwEAKI融合蛋白;(4)用体外培养的肿瘤细胞和正常对表达产物进行活性检测，贴壁细胞用结晶紫染色法，悬浮细胞用磺酞罗丹明B染色法，酶标仪检测OD值;(5)敏感细胞用ELISA法检测细胞培养上清中IL一8的含量;(6)用光镜和电镜观察敏感细胞死亡和细胞凋亡情况;(7)用流式细胞仪分析表达产物对敏感细胞凋亡率和细胞周期的影响;(8)用双荧光素酶报告基因检测法，测定表达产物对敏感细胞NF一沼的影响;(9)用pshuttie穿梭质粒将TwEAK重组到腺病毒载体上，用脂质体转染法转染HEK293细胞，PCR鉴定重组质粒。I结果】(1)成功地从中国人肝癌组织和心肌组织中克隆了可溶性TWEAK胞外区sTWEAKI和sTWEAKZ，从正常人脾脏组织中克隆了TWEAK基因，测序结果与文献一致; (2)6一his一sTWEAKI融合蛋白在BLZI菌中获得高效表达。SDS一PAGE测定分子量约为30kDa，与预期大小一致。W七stem blot结果表明，融合蛋白能与兔抗人TWEAK多克隆抗体特异性结合。超声破菌后SDS一PAGE分析表明，上清中有可溶性6his一sTWEAKI融合蛋白，纯化效果较好，纯度约90%。细胞活性检测结果表明，6his一sTwEAKI融合蛋白7一567林g/m1浓度范围内对M85、LOVO、1990、SMMC7721、Hela、L929等细胞有不同程度的杀伤作用。ELIsA检测结果表明，它能刺激1 990细胞分泌IL一8增多。细胞HE染色光镜下观察，测活细胞变圆，变小，数量明显减少。透射电镜观察1990细胞出现典型的凋亡小体，细胞核染色质浓缩，边集，胞浆膜出现空泡。流式细胞仪检测发现，1990和M85细胞的凋亡率明显增高。核转录因子研究结果表明，6his一sTWEAKI可激活LOVO和1990细胞的NF一KB; (3)MBP一sTWEAKZ融合蛋白在TBI菌中也有可溶性表达产物。SDS一PAGE测定分子量约为63kDa，与预期大小一致。表达产物对M85、LOVO、1990细胞有一定的杀伤作用。但表达量和细胞活性均较低; (4)成功地构建了重组TWEAK一腺病毒载体，获得了重组腺病毒。l结论l (1) TWEAK胞外区在大肠杆菌中获得较高的可溶性融合表达; (2)TWEAK胞外区融合蛋白具有明显的生物学活性。可诱导多种肿瘤细胞凋亡。刺激敏感细胞IL一8分泌增多; (3)引起细胞凋亡的作用机制与激活NF一沼有关; (4)获得了重组TWEAK腺病毒，其功能有待研究。