论文部分内容阅读
目的本文利用基因干扰技术来抑制人卵巢癌SKOV3细胞Notch1基因的表达,在细胞水平上进行Notch1基因敲除效率的评估。虽然基因干扰技术有着巨大的潜力,然而,siRNA易降解的特性限制其临床应用,并且siRNA递送系统仍然存在着诸多缺陷,如转染效率低、稳定性差等问题。所以,设计高效、稳定、安全的Notch1 siRNA载药系统对增强抗卵巢癌作用具有非常重要的意义。本文合成N-(N,N’-二甲基)丙基丁二酸单胆固醇酯单酰胺(DMAPA-CHEMS)阳离子胆固醇材料,合用大豆卵磷脂S100制备阳离子脂质体,并对其制剂学特征,在核酸酶和血清中的稳定性,细胞毒性,细胞摄取效率,Notch1 mRNA沉默和Notch1蛋白下调效率,增殖和凋亡方面进行了评价,为构建安全有效的siRNA载体系统提供了强有力的理论基础。方法利用胆固醇、丁二酸酐、N,N-二甲基丙二胺(DMAPA)、DCC和NHS合成DMAPA-CHEMS,与大豆磷脂S100采用薄膜法制备阳离子脂质体。利用动态激光散射仪(DLS)测DMAPA-CHEMS阳离子脂质体粒径和电位,透射电镜观察形态。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析脂质体在0.1mg/mL RNase和25% FBS环境中对siRNA保护作用。采用 CCK-8试剂盒考察了DMAPA-CHEMS阳离子脂质体和N,C-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物细胞毒性,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜考察了SKOV3对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的摄取,利用荧光定量PCR和Western Blot评价了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对Notch1基因的沉默效率。最后采用CCK-8试剂盒考查了Notch1-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞增殖的影响,细胞凋亡试剂盒测定Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞凋亡的影响。结果siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物的粒径随N/P比增加而减小。N/P=100时,粒径(100.94±3.72)nm,电位(46.54±4.32)mV。透射电镜显示其为圆形或类圆形。RNase和血清稳定性试验中,可以看到载体可以显著提高siRNA稳定性。流式细胞仪结果显示随N/P比增加,细胞摄取增加,N/P=100时,摄取达到最大值。激光共聚焦显微镜结果显示SKOV3细胞对siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物摄取效率高。荧光定量PCR结果表明N/P=100时,对SKOV3细胞Notchl mRNA表达抑制最大,其2-△△Ct为0.34±0.04,明显低于空白组0.944-0.07。Western Blot结果显示转染Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS日离子脂质体复合物24小时后即可见SKOV3细胞Notchl蛋白表达明显下调,转染72 h后蛋白表达为(26.47±6.23)%,显著低于对照组(100.00±11.02)%。CCK-8试剂盒检测细胞毒性实验可以看到DMAPA-CHEMS日离子脂质体的细胞毒性较小,浓度<100μg/mL时,转染后24 h、48 h或72 h,细胞存活率都高于80%。结果表明,DMAPA-CHEMS阳离子脂质体作为基因运送载体,本身并无明显的细胞毒性,但是Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞的增殖具有明显的抑制作用,N/P比100时,转染72 h后,细胞存活率下降到(60.45±2.24)%,与阴性对照(86.43±0.87)%有显著差异。细胞凋亡实验结果显示Notchl-siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物对SKOV3细胞的凋亡有明显促进作用。结论本研究所制备的siRNA-DMAPA-CHEMS阳离子脂质体复合物具有较小的粒径,表面带正电荷,形态为圆形或类圆形。核酸酶和血清蛋白环境中具有良好的siRNA稳定性,细胞毒性小,具有较高的细胞摄取率,较强的靶基因沉默和蛋白下调效率。