论文部分内容阅读
背景纳米材料的诞生跨越了微观世界与宏观世界的鸿沟,随着纳米技术的发展及多学科的交叉融合,纳米材料在各个领域中发挥着重要作用。但在纳米材料取得巨大成功的同时,其环境毒性、生物毒性不可规避。查阅相关文献发现:纳米材料由于其小尺寸、高表面活性、量子尺寸效应等特点,可以通过多种途径进入机体,对多个器官、系统构成潜在威胁。既往体内实验结果表明纳米材料可以通过直接跨越血脑屏障、经嗅神经、经感觉末梢神经转运入脑,使得中枢神经系统成为纳米材料蓄积的靶器官。进入大脑的纳米材料会破坏神经细胞的正常结构,导致脑血管病、神经退行性变的发生。细胞自噬作为机体维持稳态的一种正常生理过程,在清除纳米材料对神经细胞的毒性中发挥着重要的作用。研究表明,纳米材料会诱导细胞发生自噬紊乱,进而产生细胞毒性作用,因此本研究拟从细胞自噬出发,探讨自噬在纳米粒子对中枢神经细胞的损伤中的作用机制,近年来纳米材料中的介孔二氧化硅,由于具有靶向性强,负载量大,表面易修饰等特点被作为药物载体被广泛开发研究,本次实验中以介孔二氧化硅作为研究对象,为该材料的进一步发展使用及相关职业人群保护,卫生标准的制定以及相关部门的科学决策制定提供理论依据。目的本研究拟通过建立小鼠海马永生神经元细胞(HT22)的体外模型,观察经纳米材料——介孔二氧化硅(SBA-15)刺激后,细胞损伤及自噬的发生情况,并通过选择性抑制自噬相关信号通路AMPK/mTOR中AMPK的活性,观察该通路中关键蛋白的表达情况,探讨介孔二氧化硅诱导神经细胞自噬的可能机制及细胞自噬在该刺激过程中所扮演的角色。方法具体检测步骤如下:1.SBA-15表征鉴定;2.细胞损伤检测:将HT22细胞暴露于不同浓度的sba-15悬浮液中,cck-8法测定不同浓度sba-15作用ht22细胞24h后的细胞存活率,并最终确定sba-15的染毒终浓度为:50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml,以0μg/ml作为对照组,选择中剂量组100μg/ml加入10μg/mlcompoundc作为抑制剂干预组;在0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlsba-15作用24小时后,使用微量酶标法测定不同染毒浓度组培养液上清中乳酸脱氢酶(ldh)的活力;3.细胞自噬的检测:分别用吖啶橙、单丹磺酰尸胺荧光染色0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml浓度下经sba-15刺激后ht22细胞中酸性自噬泡及自噬体的生成情况;westernblot检测同等浓度刺激下ht22细胞中自噬标志性基因lc3、beclin-1的蛋白表达水平;4.自噬信号通路的抑制:westernblot检测0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、100μg/ml+10μg/mlampk抑制剂compoundc组、0μg/ml+10μg/mlcompoundc组中关键蛋白ampk、p-ampk、mtor、p-mtor、p-70s6k蛋白的表达水平。结果1.sba-15的表征:电镜下显示sba-15呈规则六方孔径结构;红外光谱及x射线衍射结果显示sba-15具有介孔二氧化硅材料的典型化学结构;粒度仪检测sba-15在无血清高糖培养基中稳定分散;2.细胞损伤检测:cck-8实验结果显示与对照组(0μg/ml)相比,在0~50μg/ml浓度范围内细胞存在小剂量增殖效应,在100~800μg/ml浓度范围内,随着染毒浓度的升高,细胞存活率降低(p<0.05);ldh实验显示:与对照组(0μg/ml)比较,细胞膜损伤程度随着sba-15浓度的升高而增大(p<0.05);3.细胞自噬检测:ao染色结果显示sba-15诱导ht22细胞酸性自噬泡的产生,且随着染毒浓度的升高红色荧光逐渐加强;mdc结果显示sba-15诱导ht22细胞自噬体的生成,且随着染毒浓度的升高自噬体数量增多,亮度增强;westernblot结果显示与对照组(0μg/ml)相比,高剂量组beclin-1蛋白表达水平下降,差异具有统计学意义(p<0.05);与对照组(0μg/ml)相比,低剂量组lc3ii/lc3i蛋白表达水平上升,提示低剂量组细胞自噬水平升高;4.自噬通路ampk/mtor中关键蛋白的表达水平:westernblot结果显示,与对照组(0μg/ml)相比,在不同染毒组之间AMPK的磷酸化水平随着染毒组浓度的升高而降低(p<0.05),随着AMPK磷酸化水平降低,信号通路下游自噬关键蛋白mTOR及70S6K的磷酸化水平随之升高,可判定通路被激活;mTOR蛋白结果显示,低剂量组与高剂量组蛋白磷酸化水平与与对照组(0μg/ml)相比,差异具有统计学意义,mTOR作为已知的自噬负调控因子,可以认为在低剂量下自噬被诱导,而高剂量下自噬被抑制;加入AMPK特异性抑制剂Compound C后,AMPK、mTOR与未加入Compound C组相比,蛋白磷酸化水平差异无统计学意义,可认为Compound C在本次实验中未起到干预作用。结论细胞毒性实验证明SBA-15对HT22细胞存在一定的细胞毒性,具体表现为低剂量作用下产生细胞增殖效应,但是随着染毒剂量的增高,细胞膜破裂程度增加,细胞存活率下降;自噬检测结果说明SBA-15可以通过AMPK/mTOR途径发挥对HT22细胞自噬的抑制作用而产生细胞毒性,但是这一结果还需进一步的开展基因沉默技术和临床研究以佐证,以期让该材料更安全有效的服务大众。