流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道传染病。甲型流感病毒感染宿主范围广、病毒很容易发生变异,因此,甲型流感病毒每年都会在全球引起不同规模的季节性流行,以及约10-15年发生一次大流行。每年,全球发生的季节性流感导致25～50万人死亡,给公共卫生带来很大的挑战。对易感人群接种相应的流感疫苗是目前预防流感的重要措施,但是,WHO选取研制的流感疫苗株会因为流感病毒的变异而失去对人群的保护。因此,本研究采用现场流行病学、实验病毒学和分子生物学方法对流感病毒变异、人群对不同甲亚型病毒的免疫保护状况,流感季节性流行、亚型分布和以时间、地区序列分析流感病毒的基因进化特征进行研究,主要包括以下4个方面内容：1.上海地区流感季节性流行与亚型分布,对2009～2010年上海地区流感病原学监测。2009年冬春季(1-25周)季节性H1N1和A／H3N2共同流行,季节性H1N1占优势,流行高峰期为1-2月份之间,在流行期末期有B型流感病毒分离。2009年夏季8月始分离到甲型H1N1流感病毒,并与A／H3N2在人群中同时流行,10月份(40周)以后的分离株主要是甲型H1N1,偶尔分离到季节性H1N1和B型流感病毒,夏秋季(26～52周)流感高峰期为8-9月份,且流行强度高于冬春季,流行持续时间长,在年末(52周)还有阳性分离株,分离株基本是甲型H1N1。这是因为甲型H1N1流感病毒在基因和抗原性上与季节性H1N1不相关联,人群的既往免疫不能有效保护。2010年1-10周,B型流感病毒与甲型H1N1病毒在人群中同时流行,期间甲型H1N1病毒活动性相对减弱,而B型流感病毒数量逐步上升,直到2010年第5周采集的标本分离到的主要是B型流感病毒。这与甲型H1N1流感病毒在人群中流行和甲型H1N1病毒疫苗接种有关。2.检测2008～2009年上海地区人群甲型流感病毒HAI抗体水平,了解人群既往感染的免疫保护状况并探讨其流行趋势。结果显示,2008年上海地区一般人群对A／广东罗湖／219／2006(H1N1)抗原的HAI抗体阳性率为38.8%(134／345),对A／江西东湖／312／2006(H3N2)HAI抗体阳性率为42.3%(115／272)；2009年上海地区一般人群对疫苗株A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Brisbane/10/2007(H3N2)有一定的免疫屏障,HAI抗体阳性率分别为70.8%(638／901)及43.5%(392／901)。2008年,上海地区一般人群和职业人群中H5亚型HAl抗体阳性率分别为0.3%(1／345)和4%(8／198),H9亚型HAI抗体阳性率分别为2.6%(9／345)和17.7%(35／198)；2009年,两组人群的H5亚型HAI抗体阳性率分别为0.3%(1／332)和4.2%(15／356),H9亚型HAI抗体阳性率分别为2.4%(8／332)和34.6%(123／356),可见人群中特别是禽畜密切接触的职业人群中存有禽流感H5、H9抗体,职业人群H5、H9抗体阳性率增高,仍为由禽至人的传播,存在人能感染H5、H9亚型禽流感病毒,但没有人-人间传播的迹象。2009年甲型H1N1流感暴发并在全世界流行,我们检测了采自2009年1月上海地区一般人群血清甲型H1N1抗体水平,显示对甲型H1N1的疫苗株抗原HAI抗体阳性率为9.2%(37／404),表明上海地区人群对于甲型H1N1流感病毒普遍缺乏免疫保护,人群对甲型H1N1流感病毒普遍易感。但不同年龄组人群对甲型H1N1流感病毒HAI抗体阳性率有差别,以老年组(≥60岁)血清抗体阳性率最高,为25.0%(21／84),其次是成年组(25岁～),血清抗体阳性率为10.0%(8／80),5-25岁年龄组血清抗体阳性率较低为2.5%(2／80)。随着甲型H1N1在上海地区流行,人群甲型H1N1抗体水平增强,2009年10月中旬,5-15岁年龄组血清抗体阳性率为26.5%(53／200)。表明在疫苗接种前,人群已经开始对甲型H1N1流感病毒产生免疫保护。3.选择一定条件甲型流感病毒进行HA、NA、PB2、M等全基因测序,并与WHO疫苗推荐株序列比较,分析甲型流感病毒基因进化。2005～2009年,季节性H1N1亚型HA基因进化树呈同一主干发展,相同年份序列相近,成簇分布；不同年份之间侧枝较长,表明序列变异较大。与A/NewCaledonia/20/1999 (H1N1)(2000～2007年的疫苗推荐株)、A/SolomonIslands/3/2006(H1N1) (2007～2008年的疫苗推荐株)相比,A/Brisbane/59/2007(H1N1) (2008～2010年的疫苗推荐株)的侧枝长度最短,表明A/Brisbane/59/2007(H1N1)对同期上海地区人群流感流行的保护性较好。但2008年夏秋季分离株及部分2009年冬春季分离株单独形成一个分枝,与疫苗推荐株A/Brisbane/59/2007 (H1N1)距离相对较远,HA基因序列变异较大。基因推断的氨基酸序列比较显示,变异位点涉及3个抗原决定区域,特有的变异位点多达十余个。2004～2009年,A／H3N2的HA基因进化树呈一个主干向上发展,侧枝很短的特征。进化树的主干很长,基本按照毒株出现的时间先后发展；但侧枝较短。相同年份毒株序列相近聚集成簇,不同年份的新旧毒株序列之间相互穿插,比较季节性H1N1流感病毒遗传继承关系更为明显。A/Brisbane/10/2007(H3N2)作为2008～2010的疫苗推荐株,距离2008～2009流感流行株主干侧枝长度较短,表明其与大部分同期流行株序列相近。基因推导氨基酸序列比较显示,变异位点位于三至四个抗原决定区域。2009年甲型H1N1的HA、NA、PB2基因进化树都呈现与季节性H1N1、A／H3N2 HA进化树相似的模式,不同区域、不同月份分离株互有穿插,呈现一定的变异继承关系。12月份以来的一些分离株侧枝较长,与主枝干距离较远,有一定的变异。HA基因推断的氨基酸序列比较显示,一些氨基酸位点已发生变异,大部分位于HA1片段上,但都不位于抗原决定区域,也没有增减潜在的糖基化位点。分离株NA基因推断的氨基酸序列中,第274位氨基酸均为H,未检测到耐奥司他韦的变异(Y),对病毒聚合酶PB2序列分析,PB2位点第627位和701位氨基酸分别是E和D,是禽源流感病毒PB2蛋白的特征。4.时间序列分析流感病毒抗原变异状况,采用金黄地鼠作为动物模型,选取2005～2009年上海地区散发和聚集性事件中的流行株,制备免疫血清,并进行交叉HAI实验,研究甲型流感病毒HA抗原的变异情况。结果显示,上海地区H3甲型流感病毒在05年以后到现在流行株抗原进化相对比较缓慢,而甲型流感H1亚型08年下半年流行株较之以前的疫苗株和流行株均发生了抗原变异。甲型H1N1流感病毒HA抗原与人季节性H1N1流感病毒抗原有很大的差异。