胰腺癌是恶性度很高的肿瘤,近年来胰腺癌的发病率有逐年上升的趋势,目前已经成为美国第四位的肿瘤死因。因为缺少有效地治疗手段,胰腺癌患者生存期短,生活质量差,5年总生存率<5%,中位生存期仅有6个月。胰腺癌的发病机制复杂,目前认为是由一系列基因突变引起的。已发现多条信号通路参与其发生和发展过程。因为胰腺癌易早期发生转移,常转移至肝、腹腔等部位,因此晚期胰腺癌患者的转移成为目前胰腺癌晚期治疗的一个重点。目前已知多个信号分子参与肿瘤的转移,包括趋化因子(chemokine)通路、血管内皮生长因子(VEGF)通路等,而对这些信号通路的深入研究有助于了解胰腺癌转移的机制并为后续靶向治疗奠定基础。ARHI基因是1999年发现的一个母源性印迹基因,是Ras超家族成员之一,其编码的蛋白在人类多种组织中表达,但在乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌中却存在表达下调,多个研究提示ARHI是一个抑癌基因。我们实验室的前期研究表明ARHI基因在胰腺癌组织中也发挥抑癌基因的作用。ARHI基因在正常胰腺组织广泛表达,但在胰腺癌组织(47.8%)和细胞(8/8)中表达下调或缺失。通过瞬时和多克隆稳定转染将ARHI基因导入表达缺失的胰腺癌细胞中,研究发现ARHI可抑制胰腺癌细胞的增殖,导致细胞周期停滞。目前尚没有文献报道已建立ARHI的单克隆稳定细胞株。本课题在前期已经建立ARHI多克隆胰腺癌稳定细胞株的基础上尝试建立单克隆的胰腺癌稳定细胞株,为后续深入研究ARHI功能打下基础,并同时初步探讨ARHI稳定表达是否会影响胰腺癌转移信号通路。第一部分ARHI基因转染胰腺癌PANC-1细胞单克隆稳定株的建立方法：应用我们实验室构建的携带ARHI基因编码序列的pIRES2-ARHI-EGFP质粒以及新构建的慢病毒质粒pLNCX2-ARHI-EGFP,采用脂质体法瞬时转染胰腺癌PANC-1细胞系,用G418筛选4周后挑选发绿色荧光的单克隆细胞,扩大培养后用RT-PCR及western blot验证ARHI基因转录及翻译情况。单克隆稳定株建立后分别用MTT法和细胞划痕实验研究ARHI对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响。研究结果：瞬时转染48小时后ARHI组可见ARHI基因mRNA表达,而空载体组及正常PANC-1细胞组无ARHI mRNA表达；ARHI组瞬时转染后24小时、48小时和72小时均可见ARHI蛋白表达,且24小时表达量最大,正常PANC-1细胞组和空载体组无ARHI蛋白表达；G418筛选4周后可见绿色团簇状细胞,经单克隆筛选后可筛选出全部发绿色荧光的PANC-1细胞；RT-PCR和western blot检测单克隆稳定细胞株均能表达ARHI,而多克隆空载体组及正常PANC-1组无ARHI的表达；单克隆稳定株中,ARHI可抑制胰腺癌细胞的增殖,在4-5天时与空载体组相比有明显的差异性(P<0.05)；细胞划痕实验显示第12小时、24小时和48小时,ARHI组细胞迁移速率比空载体组减慢,具有显著性差异(P<0.01),和PANC-1对照组相比迁移速率也减慢,同样具有显著性差异(P<0.01)。小结：1)使用普通质粒(pIRES2-EGFP)和慢病毒质粒(pLNCX2)成功构建了稳定表达ARHI的单克隆PANC-1细胞株；2)单克隆稳定株中稳定表达的ARHI可抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖和迁移。第二部分体外实验初探抑癌基因ARHI对胰腺癌转移信号通路的影响方法：应用已经建立的ARHI单克隆稳定株,通过Real-time PCR检测ARHI对趋化因子(CXCL1、CXCL8)以及VEGF通路(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和HIFa) mRNA表达量的影响；通过免疫细胞化学染色观察ARHI对细胞内VEGF表达量的影响。研究结果：和空载体组相比,单克隆稳定表达ARHI组的CXCL1、CXCL8的mRNA表达量显著低于前者,具有显著性差异(P<0.05)；单克隆稳定表达ARHI组的VEGF-A VEGF-B和HIFα的mRNA表达量高于空载体组,具有显著性差异(P<0.05),而VEGF-C的mRNA水平在两者间没有差异(P>0.05)；用VEGF单克隆抗体对ARHI单克隆稳定株进行免疫细胞化学染色,结果发现细胞内VEGF的表达量和空载体组相比无显著性差异(P>0.05)小结：1)单克隆稳定株中ARHI可抑制趋化因子CXCL1和CXCL8mRNA的表达；2)单克隆稳定株中ARHI可能促进VEGF-A. VEGF-B和HIFa mRNA的表达。结论：1)通过两种质粒成功建立能稳定表达ARHI的单克隆PANC-1细胞株。2)单克隆稳定株中稳定表达的ARHI抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖和迁移。3)稳定表达的ARHI在PANC-1细胞中可抑制趋化因子CXCL1和CXCL8mRNA的表达。4)稳定表达的ARHI在PANC-1细胞中可能促进VEGF mRNA的表达。