副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是水产品中主要的食源性致病菌,易粘附在各种食品和食品接触材料表面,通过自身的繁殖并分泌大量的代谢产物,将细菌包裹其中而形成复杂的三维立体膜状结构,即细菌生物被膜(Biofilm,BF)。生物被膜可以大大增强细菌对各种外界环境因素(消毒剂、压力、低温等)的抵抗性,给食品加工和生产带来严重的负担。在自然界中,VP的生长繁殖和海水温度的变化密切相关;在食品的生产和加工过程中,VP需要经历一系列的温度变化过程。因此,对不同温度下VP生物被膜的动态形成过程及温度影响生物被膜形成的机制进行探究,对于食品安全和食品工业的发展均有重要的意义。本研究以VP为研究对象,首先,对不同温度(15 oC,25 oC,37oC)条件下生物被膜的动态形成过程进行分析;其次,探究了预形成的生物被膜经历低温冷击后形成特性的变化;最后,利用拉曼光谱和反转录荧光定量PCR(RT-q PCR)等方法探究温度影响生物被膜的初步机理,为有效控制生物被膜的形成提供理论参考。本文主要研究内容及研究结果如下:1.不同温度条件下副溶血弧菌生物被膜的动态形成过程本研究运用结晶紫染色法分析了食品中分离的VP在不同温度下的动态形成过程,并比较了临床分离与食品分离的VP的被膜形成能力,最后利用共聚焦激光扫描显微镜观察BF形成过程中的结构变化。结果显示,15 oC时,BF的形成量随着培养时间的延长而逐渐增加;25 oC时,25 oC时BF的形成能力最强,BF的形成量在前期逐渐增加直至24 h时达到最大量;而37 oC时,BF增加缓慢。此外,致病性VP的被膜形成能力强于非致病性VP;临床分离VP的BF形成能力显著强于(p<0.05)食品分离菌株。变异性分析显示,菌株的变异性随着培养温度的升高而逐渐增大,培养时间为12 h时变异性最大。2.低温刺激对预形成的副溶血性弧菌生物被膜形成特性的影响本文研究了低温(4 oC,10 oC)刺激对预形成的VP生物被膜形成特性的影响,并分析了被膜菌的活菌数变化。结果表明,与37 oC恒温培养条件相比,低温刺激后BF的形成速度降低,但随着培养时间的延长,BF的形成量逐渐增加至与恒温培养的形成量相近。EPS分析发现,低温刺激后胞外多糖和胞外蛋白仍呈现出逐渐增加的趋势,并在48 h时达到最大,然后开始逐渐下降;平板涂布法测定低温刺激后被膜菌的活菌数发现,低温刺激后的被膜菌的活菌数显著高于(p<0.05)未低温刺激的活菌数。以上结果表明,低温刺激只能减缓生物被膜的形成速度,细菌一旦适应了低温环境就会快速的生长繁殖并形成更多的生物被膜;低温刺激还可以有效的保护细菌,从而危害食品安全。3.温度影响副溶血性弧菌生物被膜的初步机理本研究利用扫描电镜观察了不同温度下BF的形态结构,并利用拉曼光谱和RT-q PCR等方法,从代谢产物和基因水平探究了温度影响VP生物被膜的初步机理。结果表明,25 oC时BF的结构最致密,胞外多糖和胞外蛋白的量也最大,37 oC次之,15 oC较弱,4 oC最弱。拉曼光谱分析发现,不同温度下的特征峰数量和强度均有显著性差异(p<0.05),25 oC时特征峰的数量最多,强度也最强,4 oC的特征峰数量最少最弱;不同温度下的差异特征峰对应的物质主要有:碳水化合物、蛋白质和类胡萝卜素。RT-q PCR分析显示,温度主要是通过影响细菌的运动性和群体感应来影响生物被膜的形成。