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研究背景
胆红素脑病(Bilirubin encephalopathy)和胆红素脑损伤(bilirubin-induced brain injury)是因血清胆红素透过血脑屏障并在基底节、海马等部位沉积而引起的急性中毒性脑损伤，是临床上导致新生儿残疾的重要原因之一，严重者50%~75%死于胆红素脑病急性期，存活的患儿中75%~90%遗留有不同程度的神经系统后遗症，包括精细运动障碍、运动发育延迟、认知障碍及听觉障碍(听神经病变、失听或者耳聋)，严重者出现重度锥体外系运动障碍及显著的听觉、眼运动、认知功能异常，对社会和家庭造成极大的负担。研究表明，胆红素脑病和胆红素脑损伤的发生与进入中枢神经系统的未结合胆红素含量有直接关系，尤其是生后1周内的早期新生儿，其血脑屏障通透性较高，中枢神经系统对毒性物质十分敏感，所以在血清未结合胆红素水平较高的情况下极易发生胆红素脑病和胆红素脑损伤。因此，降低血脑屏障对血清中未结合胆红素的通透性，最大限度的减少进入中枢神经系统的胆红素，是预防胆红素脑病和胆红素脑损伤发生的关键因素之一。近几年，许多研究表明肠道菌群对神经系统的发育和功能有重要影响，包括突触形成、递质释放、营养物质的产生、血脑屏障的发育等。虽然知道胆红素脑损伤的发生与血脑屏障功能有关，但是对于生后早期胆红素血脑屏障的通透性及其影响因素尚不十分明确，是否与肠道菌群的构成具有相关性目前尚无文献报道。为此，本实验拟通过前瞻性研究，利用16SrDNA序列分析技术检测严重高胆红素血症新生儿肠道菌群构成情况，比较发生胆红素脑损伤和未发生胆红素脑损伤新生儿肠道菌群构成的差异，旨在阐明肠道菌群与胆红素脑损伤发生的关系，为减少和预防胆红素脑损伤的发生提供新的思路。
目的
1.探讨严重高胆红素血症(血清总胆红素水平＞342μmol/L)新生儿脑脊液胆红素水平及与胆红素脑损伤的关系。
2.采用16SrDNA序列分析技术和生物信息学分析技术探讨严重高胆红素血症新生儿肠道菌群的构成情况及其与胆红素脑损伤之间的关系。
材料与方法
1.研究对象标本采集。2016年9月~2017年3月广州市妇女儿童医疗中心新生儿科收治的入院时血清总胆红素水平＞342μmol/L的新生儿，入院后在给予相应治疗前抽取静脉血2ml、行腰椎穿刺术留取脑脊液2ml，测定血清、脑脊液中未结合胆红素水平，同时采集患儿大便标本。根据《实用新生儿学》中的诊断标准以及MRI和脑干听觉诱发电位(BAEP)检查结果，将研究对象分为脑损伤组(26例)和无脑损伤组(28例)。
2.肠道菌群16SrDNA测序。将所有采集到的高胆红素患儿大便标本利用酶法(Stool Genomic DNA Kit)提取细菌DNA，针对细菌16SrDNA的V3-V4区域进行扩增。使用Illumina建库试剂盒对扩增后样本进行建库，建库完成后使用IlluminaMiseq测序平台对PCR产物进行测序。
3.应用相关软件对PCR产物进行生物信息学处理和分析。基于对PCR产物测序所得有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计描述。最后在以上分析的基础上挖掘样品之间菌群构成差异。
结果
1.研究对象一般情况
本研究最终纳入54例符合标准的严重高胆红素新生儿，其中发生胆红素脑损伤(脑损伤组)26例，未发生胆红素脑损伤(无脑损伤组)28例，两组研究对象性别、体质量、胎龄、分娩方式、喂养方式比较差异无统计学意义(p均＞0.05)。
2.脑损伤组与无脑损伤组新生儿血清未结合胆红素水平、脑脊液未结合胆红素水平及两者比值的比较脑损伤组脑脊液未结合胆红素水平为9.53±2.68μmol/L，无脑损伤组脑脊液未结
合胆红素水平为6.94±2.31μmol/L，两组比较差异具有统计学意义(t=3.147p=0.0027)；两组新生儿脑脊液中未结合胆红素水平与血清中未结合胆红素水平无相关性(r=0.137,0.081，p＞0.05)；脑损伤组脑脊液与血清未结合胆红素比值为(2.93±1.16)%，无脑损伤组脑脊液与血清未结合胆红素比值为(1.79±1.08)%，两组比较差异有统计学意义(t=2.066，p=0.043)。
3.脑脊液未结合胆红素水平与脑损伤严重程度的关系
根据BAEP诊断分级标准，脑损伤组中有22例出现不同程度的BAEP异常，异常比例为84.6%，BAEP轻度、中度、重度异常新生儿脑脊液未结合胆红素水平之间的差别具有统计学意义(F=13.957，p=0.000)；进一步两两比较，中度异常组与轻度异常组脑脊液未结合胆红素水平差异有统计学意义(Bonferroni法，p=0.014)；重度异常组与中度异常组脑脊液未结合胆红素水平差异有统计学意义(Bonferroni法，p=0.026)。
4.脑损伤组与无脑损伤组患儿肠道菌群结构的差异性
利用16SrDNA序列分析技术对高胆红素血症患儿肠道菌群进行研究，新生儿肠道中有来自10多个菌门的100多种细菌种系被鉴定出来，通过稀释曲线、Chao1指数、Shannon指数对各组样本进行复杂度分析，证实测序深度足以覆盖肠道内细菌种属，各组样品丰富度和均匀度均达到实验标准。通过α-多样性参数比较分析得知在属水平上脑损伤组肠道菌群丰度低于无脑损伤组，差异具有统计学意义，其中以Fusobacterium、Catabacter、Succinivibrio、Clostridium、Bacteroides这5类菌属差异显著(p均＞0.05)。
5.属水平上差异性菌群的生物信息学分析
根据微生物学分类，Catabacter、Clostridium这两类菌属来自梭菌目，Fusobacterium来自于梭杆菌目，Succinivibrio来自于琥珀酸弧菌属，Bacteroides来自于拟杆菌属。而梭菌、梭杆菌、拟杆菌以及琥珀酸弧菌在结肠内通过代谢碳水化合物能产生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等一系列短链脂肪酸，这些是肠道内短链脂肪酸的重要来源。短链脂肪酸是具有促进肠道蠕动，参与调解食欲，以及通过促进紧密连接蛋白的表达从而达到增强上皮细胞屏障功能的作用。
结论
1.胆红素脑损伤的发生直接取决于脑脊液的未结合胆红素水平；脑脊液中未结合胆红素水平越高，脑损伤严重程度相应增加；脑脊液未结合胆红素水平可作为早期诊断足月新生儿胆红素脑损伤的参考指标，具有十分重要的临床价值。
2.除血清未结合胆红素水平之外，血脑屏障通透性可能也是影响胆红素脑损伤发生的重要因素。
3.胆红素脑损伤新生儿肠道菌群多样性明显低于无脑损伤新生儿。高胆红素血症新生儿脑脊液胆红素水平的高低可能与肠道菌群构成不同引起的胆红素血脑屏障通透性差异有关。
胆红素脑病(Bilirubin encephalopathy)和胆红素脑损伤(bilirubin-induced brain injury)是因血清胆红素透过血脑屏障并在基底节、海马等部位沉积而引起的急性中毒性脑损伤，是临床上导致新生儿残疾的重要原因之一，严重者50%~75%死于胆红素脑病急性期，存活的患儿中75%~90%遗留有不同程度的神经系统后遗症，包括精细运动障碍、运动发育延迟、认知障碍及听觉障碍(听神经病变、失听或者耳聋)，严重者出现重度锥体外系运动障碍及显著的听觉、眼运动、认知功能异常，对社会和家庭造成极大的负担。研究表明，胆红素脑病和胆红素脑损伤的发生与进入中枢神经系统的未结合胆红素含量有直接关系，尤其是生后1周内的早期新生儿，其血脑屏障通透性较高，中枢神经系统对毒性物质十分敏感，所以在血清未结合胆红素水平较高的情况下极易发生胆红素脑病和胆红素脑损伤。因此，降低血脑屏障对血清中未结合胆红素的通透性，最大限度的减少进入中枢神经系统的胆红素，是预防胆红素脑病和胆红素脑损伤发生的关键因素之一。近几年，许多研究表明肠道菌群对神经系统的发育和功能有重要影响，包括突触形成、递质释放、营养物质的产生、血脑屏障的发育等。虽然知道胆红素脑损伤的发生与血脑屏障功能有关，但是对于生后早期胆红素血脑屏障的通透性及其影响因素尚不十分明确，是否与肠道菌群的构成具有相关性目前尚无文献报道。为此，本实验拟通过前瞻性研究，利用16SrDNA序列分析技术检测严重高胆红素血症新生儿肠道菌群构成情况，比较发生胆红素脑损伤和未发生胆红素脑损伤新生儿肠道菌群构成的差异，旨在阐明肠道菌群与胆红素脑损伤发生的关系，为减少和预防胆红素脑损伤的发生提供新的思路。
目的
1.探讨严重高胆红素血症(血清总胆红素水平＞342μmol/L)新生儿脑脊液胆红素水平及与胆红素脑损伤的关系。
2.采用16SrDNA序列分析技术和生物信息学分析技术探讨严重高胆红素血症新生儿肠道菌群的构成情况及其与胆红素脑损伤之间的关系。
材料与方法
1.研究对象标本采集。2016年9月~2017年3月广州市妇女儿童医疗中心新生儿科收治的入院时血清总胆红素水平＞342μmol/L的新生儿，入院后在给予相应治疗前抽取静脉血2ml、行腰椎穿刺术留取脑脊液2ml，测定血清、脑脊液中未结合胆红素水平，同时采集患儿大便标本。根据《实用新生儿学》中的诊断标准以及MRI和脑干听觉诱发电位(BAEP)检查结果，将研究对象分为脑损伤组(26例)和无脑损伤组(28例)。
2.肠道菌群16SrDNA测序。将所有采集到的高胆红素患儿大便标本利用酶法(Stool Genomic DNA Kit)提取细菌DNA，针对细菌16SrDNA的V3-V4区域进行扩增。使用Illumina建库试剂盒对扩增后样本进行建库，建库完成后使用IlluminaMiseq测序平台对PCR产物进行测序。
3.应用相关软件对PCR产物进行生物信息学处理和分析。基于对PCR产物测序所得有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，再对OTUs进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计描述。最后在以上分析的基础上挖掘样品之间菌群构成差异。
结果
1.研究对象一般情况
本研究最终纳入54例符合标准的严重高胆红素新生儿，其中发生胆红素脑损伤(脑损伤组)26例，未发生胆红素脑损伤(无脑损伤组)28例，两组研究对象性别、体质量、胎龄、分娩方式、喂养方式比较差异无统计学意义(p均＞0.05)。
2.脑损伤组与无脑损伤组新生儿血清未结合胆红素水平、脑脊液未结合胆红素水平及两者比值的比较脑损伤组脑脊液未结合胆红素水平为9.53±2.68μmol/L，无脑损伤组脑脊液未结
合胆红素水平为6.94±2.31μmol/L，两组比较差异具有统计学意义(t=3.147p=0.0027)；两组新生儿脑脊液中未结合胆红素水平与血清中未结合胆红素水平无相关性(r=0.137,0.081，p＞0.05)；脑损伤组脑脊液与血清未结合胆红素比值为(2.93±1.16)%，无脑损伤组脑脊液与血清未结合胆红素比值为(1.79±1.08)%，两组比较差异有统计学意义(t=2.066，p=0.043)。
3.脑脊液未结合胆红素水平与脑损伤严重程度的关系
根据BAEP诊断分级标准，脑损伤组中有22例出现不同程度的BAEP异常，异常比例为84.6%，BAEP轻度、中度、重度异常新生儿脑脊液未结合胆红素水平之间的差别具有统计学意义(F=13.957，p=0.000)；进一步两两比较，中度异常组与轻度异常组脑脊液未结合胆红素水平差异有统计学意义(Bonferroni法，p=0.014)；重度异常组与中度异常组脑脊液未结合胆红素水平差异有统计学意义(Bonferroni法，p=0.026)。
4.脑损伤组与无脑损伤组患儿肠道菌群结构的差异性
利用16SrDNA序列分析技术对高胆红素血症患儿肠道菌群进行研究，新生儿肠道中有来自10多个菌门的100多种细菌种系被鉴定出来，通过稀释曲线、Chao1指数、Shannon指数对各组样本进行复杂度分析，证实测序深度足以覆盖肠道内细菌种属，各组样品丰富度和均匀度均达到实验标准。通过α-多样性参数比较分析得知在属水平上脑损伤组肠道菌群丰度低于无脑损伤组，差异具有统计学意义，其中以Fusobacterium、Catabacter、Succinivibrio、Clostridium、Bacteroides这5类菌属差异显著(p均＞0.05)。
5.属水平上差异性菌群的生物信息学分析
根据微生物学分类，Catabacter、Clostridium这两类菌属来自梭菌目，Fusobacterium来自于梭杆菌目，Succinivibrio来自于琥珀酸弧菌属，Bacteroides来自于拟杆菌属。而梭菌、梭杆菌、拟杆菌以及琥珀酸弧菌在结肠内通过代谢碳水化合物能产生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等一系列短链脂肪酸，这些是肠道内短链脂肪酸的重要来源。短链脂肪酸是具有促进肠道蠕动，参与调解食欲，以及通过促进紧密连接蛋白的表达从而达到增强上皮细胞屏障功能的作用。
结论
1.胆红素脑损伤的发生直接取决于脑脊液的未结合胆红素水平；脑脊液中未结合胆红素水平越高，脑损伤严重程度相应增加；脑脊液未结合胆红素水平可作为早期诊断足月新生儿胆红素脑损伤的参考指标，具有十分重要的临床价值。
2.除血清未结合胆红素水平之外，血脑屏障通透性可能也是影响胆红素脑损伤发生的重要因素。
3.胆红素脑损伤新生儿肠道菌群多样性明显低于无脑损伤新生儿。高胆红素血症新生儿脑脊液胆红素水平的高低可能与肠道菌群构成不同引起的胆红素血脑屏障通透性差异有关。