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硫氧还蛋白Thioredoxin（Trx）是一种小的热稳定酸性蛋白,通过其活性部位二硫醇的可逆氧化改变靶蛋白的氧化状态。Trx是细胞中重要的氧化还原蛋白,具有调节细胞抗氧化、抗胁迫、细胞凋亡、DNA结合转录因子活性等功能。根瘤菌是一种好氧革兰氏阴性细菌,与豆科植物能形成共生固氮根瘤。根瘤中的固氮酶对氧极为敏感,因此,根瘤菌需通过防氧屏障来保护固氮酶的活性。通过生物信息分析,在豌豆根瘤菌RL3841（Rhizobium leguminosarum bv.Viciae 3841）基因组中发现3个硫氧还蛋白编码基因:trxA（RL0025）,trxB（RL4571）,trxC（RL4663）。本研究通过基因同源重组和转导技术,构建硫氧还蛋白单、双和三（全）基因突变株,系统研究豌豆根瘤菌硫氧还蛋白在抗氧化和共生固氮中的作用。将trxA、trxB和trxC克隆到根瘤菌自杀载体pK19mob和pJQ200SK上,构建出重组载体pKtrxA、pJQtrxB?Tc和pJQtrxC?Spe。再经三亲本接合实验,将重组质粒整合到豌豆根瘤菌RL3841基因组中。然后利用抗性或蔗糖致死筛选出三个trx单基因突变株RLtrxA、RLtrxB、RLtrxC和双基因缺失突变株RLtrxAtrxB。最后利用噬菌体转导技术构建双基因缺失突变株RLtrxAtrxC和RLtrxBtrxC,以及三基因缺失突变株RLtrxAtrxBtrxC。利用PCR方法扩增出3个硫氧还蛋白结构基因片段,然后将目的片段克隆到pET-28a原核表达载体,转化BL21（DE3）表达菌。SDS-PAGE电泳得到目的条带,TrxA、TrxB、TrxC分别为12 kDa、35.1 kDa、25.7 kDa。以2-硝基苯甲酸（DTNB）为底物测定目的蛋白酶活,通过Michaelis-Menten方程与Lineweaver-Burk曲线得到相应的Km分别为1.86 mmol·L-1、2.0mmol·L-1和1.79 mmol·L-1。在以葡萄糖为唯一碳源的AMS基本培养基中,trxs单基因和双基因突变对根瘤菌生长都没有影响。氧化物胁迫实验结果表明,trxs单基因和双基因突变对不同浓度的无机氧化物H2O2和有机氧化物过氧化氢异丙苯（CuOOH）均不敏感。但是与野生株RL3841相比,trx三基因突变株RLtrxAtrxBtrxC生长显著减慢,并且抗氧化能力显著降低。通过根瘤菌与甜豌豆的盆栽实验,研究了trxs基因在根瘤菌共生固氮中的功能。所有硫氧还蛋白基因突变株形成异常结构的根瘤,其固氮酶活都显著低于野生型RL3841。将4周的突变体根瘤用于石蜡切片及电镜超薄切片,观察根瘤及类菌体形态,发现根瘤形态发生变形,trxs基因突变株根瘤中含类菌体细胞数明显减少,并出现部分类菌体自溶,表明trxs基因在根瘤类菌体分化和防止根瘤过早衰亡中发挥重要作用。利用实时荧光定量RT-PCR检测trx相关基因的mRNA表达水平,结果显示,在1 mM H2O2胁迫条件下,所有三个trxs单基因突变株和三基因突变株中的应激反应基因orhB,katE,katG都上调,这些结果表明,trxs基因突变会改变细胞内的氧化还原状态,并增加相关抗氧化酶的表达。相反,RLtrxA,RLtrxB,RLtrxC和RLtrxAtrxBtrxC等突变株接种4周根瘤类菌体共生基因nifD、hmuS和rirA表达量下调,这是trxs基因突变影响根瘤菌共生固氮功能的原因。