肿瘤抑素抗肿瘤活性相关肽治疗喉鳞状细胞癌的实验研究目的喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。由于喉部周围有致密的结缔组织膜包围，静脉化疗药物很难达到病灶，经多年临床观察放疗的疗效亦不佳，因此目前喉癌的治疗仍以手术切除为主。然而由于喉部具有重要的生理功能，部分患者术后的呼吸、吞咽和发声等功能受到严重影响，给生活带来诸多不便。尽管如此，仍有部分患者死于复发和转移。因此，寻找一种新的喉癌治疗方法成为耳鼻咽喉科和肿瘤科学者所关注的课题。近年来相对无创、副作用小的生物治疗倍受瞩目。血管生成对肿瘤的生长、浸润和转移具有重大意义，当肿瘤体积超过2～3mm³时，不仅需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物，还需其提供转移的通道。抑制新生血管的生成可使肿瘤细胞进入休眠状态并诱导凋亡。因而以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗成为近年来的研究热点。肿瘤抑素（tumstatin）是Ⅳ型胶原α3链的NC1结构域的一个多肽片段，由244个氨基酸残基组成，相对分子量为28kDa。在20世纪80年代作为肺-肾出血综合症的抗原被发现Ⅲ。2000年，Kamphaus发现它有2个不同的抗肿瘤活性区，一个是靠近C端185～203位氨基酸构成的19肽，具有抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡的直接抗肿瘤作用。另一个是接近N端74-98位氨基酸组成的T7肽，具有抑制肿瘤血管生成的间接抗肿瘤作用。肿瘤抑素是目前发现的最强的血管生成抑制因子，作用强于内皮抑素10倍以上。它的作用机制是与αvβ3结合，抑制FAK、pI3激酶、PKB的活性，导致整合素介导的CAP依赖性蛋白合成途径受阻，选择性地抑制内皮细胞生长，故有强烈的抗血管生成作用。因此利用肿瘤抑素来治疗肿瘤成为目前国内外的研究热点。肿瘤抑素属于小分子蛋白，直接生物合成造价太高，不利于临床大规模应用。另外它是否能够治疗喉癌，国内外上未见报道。本研究旨在探讨利用生物工程的方法获得肿瘤抑素功能肽的最佳条件，并进一步确定其对喉鳞癌的治疗作用及可能的机制。为肿瘤抑素的临床应用奠定理论基础。方法1、肿瘤抑素19肽的提纯与检测：19肽基因工程表达菌于含有氨卞青霉素的LB培养基中进行培养，至A₆₀₀值为0.5时，加入IPTG诱导表达，收集菌体沉淀。通过反复冻融和超声波粉碎法裂解菌体。应用蛋白纯化-亲和层析法提纯19肽。用Bradford法进行19肽蛋白浓度测定，采用高效液相法测19肽纯度。2、MTT比色实验检测不同浓度肿瘤抑素19肽对喉癌Hep-2细胞生长的抑制程度。3、台盘兰法绘制生长曲线检测不同时间肿瘤抑素19肽对喉癌Hep-2细胞生长的抑制程度。4、DNA“梯状”电泳检测肿瘤抑素19肽作用下喉癌Hep-2细胞凋亡的情况。5、电镜观察肿瘤抑素19肽作用后的细胞形态变化。6、细胞凋亡实验（TUENL）检测细胞凋亡。7、流式细胞仪检测细胞周期变化。8、Western Blot实验：检测肿瘤抑素19肽作用后Hep-2细胞胞浆和线粒体蛋白中的Bcl-2、Bax、细胞色素C以及Caspase-3 P20亚单位的表达变化。9、饲养裸鼠，种植喉癌Hep-2细胞使之生长，复制喉癌裸鼠动物模型。10、荷瘤裸鼠实验：实验组每日肿瘤周围皮下注射肿瘤抑素，对照组注射PBS液。治疗过程中裸鼠置层流架中继续饲养到实验设计时间。实验过程中，每天定时观察各组裸鼠精神状态、活动、饮食，测量其体重及瘤体积变化。11、裸鼠处死后，剥离肿瘤，测量净体积及重量。取部分肿瘤组织置于液氮保存，其余制成蜡块备用。12、电镜观察肿瘤超微结构变化。免疫组化检测肿瘤血管生成情况的变化。结果1、肿瘤抑素19肽的提纯与检测：19肽融合蛋白的表达量在28℃，IPTG浓度在0.1～1.0mmol/L的范围内，诱导时间6h表达量可达到最大。测得的19肽的浓度范围是0.26～0.44μg/μl。经高效液相分析，提取纯化的19肽纯度超过90％。2、MTT比色实验：肿瘤抑素19肽对喉癌Hep-2细胞的生长有明显抑制作用，随着肿瘤抑素19肽浓度的增加，喉癌Hep-2细胞的存活率下降。3、生长曲线：肿瘤抑素19肽对喉癌Hep-2细胞的生长有明显抑制作用，随着时间延长存活细胞逐渐减少。4、电镜下肿瘤抑素19肽作用的Hep-2细胞呈凋亡改变。5、DNA梯状电泳：治疗组喉癌Hep-2细胞呈现典型的梯状降解纹带。6、细胞凋亡（TUNEL）实验：肿瘤抑素19肽作用后的喉癌Hep-2细胞出现大量凋亡。7、细胞周期检测：治疗组与对照组相比较G0-G1、G2-M期细胞所占的比例明显增多，说明19肽有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。8、Western blot结果；实验组Hep-2细胞的胞浆和线粒体中Bax表达增加，胞浆中Bcl-2表达减少，胞浆中细胞色素C表达显著增加，线粒体中细胞色素C表达显著减少，胞浆中Caspase-3 p20表达明显增加。说明肿瘤抑素19肽诱导喉癌Hep-2细胞凋亡通过线粒体途径。9、肿瘤抑素19肽对人喉癌裸鼠模型治疗效果：两组裸鼠的鼠净重、瘤重、瘤体积和瘤重/鼠净重比均存在显著差异。治疗组抑瘤率为57.07％。10、免疫组化显示，肿瘤抑素治疗组微血管密度明显下降。电镜可见，治疗组细胞呈凋亡改变。结论1、高效表达并提取得到了肿瘤抑素直接抗肿瘤活性相关肽-19肽。2、体外实验证明肿瘤抑素19肽能够明显诱导喉癌Hep-2细胞凋亡。3、肿瘤抑素19肽诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的机制是通过线粒体途径。4、肿瘤抑素19肽能够有效治疗喉鳞癌裸鼠模型。