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目的构建人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/VEGF165,并探讨pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓血管内皮祖细胞(EPCs)的体外研究。方法将合成的VEGF165基因序列克隆至pCR2.1-TOPO载体,测序鉴定证实基因碱基序列无误后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)/VEGF165重组质粒。体外分离、培养、鉴定EPCs,设立Ⅰ组pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染EPCs组;Ⅱ组pcDNA3.1(+)空质粒转染EPCs组;Ⅲ组单纯EPCs组。转染VEGF165后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测第1、3、5、7、9、11、13d EPCs培养上清液中VEGF蛋白水平,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达,噻唑蓝(MTT)检测VEGF165质粒转染后对EPCs的影响。结果经基因测序、酶切鉴定和PCR鉴定证实pcDNA3.1(+)/VEGF165重组质粒构建成功。EPCs表达CD34、CD133及KDR细胞表面标志,ELISA检测结果表明pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组VEGF蛋白水平较其他两组高,其差异具有统计学意义(P<0.05)。PCR后凝胶电泳显示转染后的EPCs内表达VEGF165mRNA,MTT显示VEGF165质粒转染可促进EPCs增殖。结论成功构建了pcDNA3.1(+)/VEGF165真核表达质粒。EPCs可成功转染VEGF165基因,EPCs体外培养仅有微量VEGF165表达,应用pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染,可使SD大鼠内皮祖细胞高效表达VEGF165并促进EPCs增殖。