猪卵母细胞冷冻保存作为猪种质资源静态保存的一个重要手段,受到越来越广泛的关注。与人类及小鼠、牛、羊等其他哺乳动物相比,猪卵母细胞冷冻的效率仍然偏低,冷冻损伤机理的研究相对匮乏;要解决冷冻保存问题,有必要深入研究冷冻机理。哺乳动物胚胎或卵母细胞冷冻保存引发的细胞凋亡与线粒体损伤,被认为是导致其冻后活力下降的主因。迄今为止,尚缺乏专门针对猪卵母细胞冻后凋亡情况、线粒体损伤和基因表达变化的系统研究。阐明卵母细胞冻后凋亡发生的主要途径,对改善卵母细胞冷冻保存策略,提高冻后存活率与发育能力,具有重要的理论意义和实用价值。本研究首先通过观察猪MⅡ期卵母细胞冻后线粒体分布、超微结构、功能和相关基因表达的变化,系统研究冷冻对猪卵母细胞线粒体功能的影响;再利用Annexin V-FITC和FITC-VAD-FMK染色对冷冻卵母细胞分别进行早期凋亡和总caspase活力检测,并对死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径的关键基因进行分子和蛋白活性检测,初步阐明猪卵母细胞玻璃化冷冻保存后的细胞凋亡模式。由于冻后卵母细胞的恢复有助于提高其存活率和发育能力,本研究还通过观察解冻后不同孵育培养时间对猪MⅡ期卵母细胞线粒体功能、细胞凋亡和发育能力的影响,以确定冻后的最佳体外培养时间;鉴于线粒体对卵母细胞发育的重要作用及其在冷冻中的氧化损伤,本研究一方面利用抗氧化剂白藜芦醇(Resveratrol,RES)添加于卵母细胞成熟培养液中,研究其对猪卵母细胞作用的最佳浓度和途径,探讨添加白藜芦醇对猪卵母细胞抗冻能力的影响;另一方面,在冻后恢复液中,通过添加白藜芦醇观察卵母细胞凋亡和不同凋亡途径中相关凋亡基因表达的情况,阐明冻后添加白藜芦醇对卵母细胞的冷冻保护作用及原理。此外,本研究还利用猪全基因组表达谱芯片对冷冻前后的猪卵母细胞进行全基因组表达检测,筛选差异表达基因,并对其进行GO和pathway分析,以寻找影响猪卵母细胞冻后损伤的关键分子与调控通路;为进一步提高猪卵母细胞冷冻效率提供理论指导和实验参考。本研究共分6个部分,主要研究内容与结果如下。试验一、玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞线粒体功能与凋亡的影响为了查明猪MⅡ期卵母细胞OPS(Open Pulled Straw,OPS)玻璃化冷冻后的线粒体损伤,阐明线粒体损伤在凋亡和冻后卵母细胞发育中的作用,本试验对冻后卵母细胞的线粒体膜电位(△Ψm值)、ROS(Reactive oxygen species,ROS)水平、ATP含量、线粒体分布、线粒体超微结构、Annexin V-FITC染色的早期凋亡率、FDA染色存活率、孤雌激活发育率及线粒体相关基因的表达情况进行系统检测。结果表明:(1)冻后卵母细胞的线粒体膜电位值(1.05)显著低于新鲜卵母细胞(1.24,P<0.05);(2)玻璃化冷冻组卵母细胞ROS水平显著高于对照组,其ATP含量则显著低于对照组(P<0.05);(3)Annexin V-FITC染色早期凋亡比例在OPS玻璃化冷冻组为57.6%,显著高于新鲜卵母细胞对照组的8.53%(P<0.05),OPS组的FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率则显著低于对照组(P<0.05);(4)玻璃化冷冻不仅破坏了线粒体在卵母细胞的正常分布,并对细胞超微结构产生严重的损害;(5)玻璃化冷冻后DNM1(Dynamin1,DNM1)基因表达量上调,其他4个基因SOD1、Mfn2、BAX和Bcl2的表达则下调。综上所述,玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞的线粒体结构和功能均产生显著影响,早期细胞凋亡也在卵母细胞冷冻后被大量检测到。线粒体内源性凋亡途径可能参与了猪卵母细胞冻后凋亡的发生。试验二、猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻后的凋亡模式为阐明猪卵母细胞玻璃化冷冻后的细胞凋亡模式,本试验利用原位荧光染色技术对冻后卵母细胞死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径中的关键caspase3、caspase8、caspase9和总caspase活性进行检测,用RT-PCR技术对不同途径的关键基因进行mRNA表达检测。结果显示,猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,无论是死亡受体外源性凋亡途径的caspase 8荧光强度值(32.03),还是线粒体内源性凋亡途径的caspase 9荧光强度值(16.56),以及两者共同途径中的caspase 3和总caspase荧光强度值(16.70和8.43)均显著高于新鲜卵母细胞对照组所对应的荧光强度值(分别为4.02、4.83、4.23和3.08;P<0.05)。死亡受体外源性凋亡途径TNFα(Tumor necrosis factor-α,TNFα)、FasL(Fas ligand,FasL)、CASP8和CASP3基因表达量也均有一定水平的提高,线粒体介导的内源性凋亡途径中,CASP9、CASP3和P53基因表达水平呈上升趋势,而Bcl2、BAX、SOD1和survivin的基因表达水平显著下降(P<0.05)。综上所述,死亡受体介导的外源性凋亡和线粒体介导的内源性凋亡共同参与了猪MⅡ期卵母细胞冻后的凋亡过程。试验三、体外培养时间对猪MⅡ期卵母细胞冻后线粒体功能、凋亡与发育的影响本试验旨在确定猪卵母细胞冷冻-解冻后的最佳体外培养时间。猪卵母细胞经冷冻-解冻后分别体外培养0、1、2和4h,然后进行线粒体膜电位、ATP含量、ROS水平、早期凋亡比例、总caspase水平、FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率检测。结果显示:(1)卵母细胞冷冻-解冻后培养2和4 h,线粒体膜电位值分别为1.19和1.26,虽显著低于新鲜卵母细胞(1.34;P<0.05),但与培养1 h组的线粒体膜电位值(1.06)相比有显著提高(P<0.05);(2)ROS水平在冻后培养1 h卵母细胞表现为最高(69.54),增加冻后培养时间,ROS水平则有下降趋势,其中以培养2 h最低(52.81);ATP含量也表现为在冻后1 h最低,延长培养时间至2和4 h,ATP含量逐渐升高;(3)在早期凋亡中,Annexin V-FITC染色结果表明,冻后卵母细胞凋亡阳性比例在体外培养2 h组最低(43.18%),总caspase水平在卵母细胞冻后培养1 h组最高,达17.28;延长恢复培养时间至2 h,caspase水平显著下降(4.38);(4)冻后卵母细胞FDA染色存活率随着培养时间延长表现为持续下降,但孤雌激活卵裂率却表现为升高趋势,其中以培养2 h组最高(19.84%),继续延长培养时间至4 h,卵裂率有所下降。试验四、体外成熟液中添加白藜芦醇对猪卵母细胞体外发育、抗冻能力与基因表达的影响为探究成熟培养液中添加白藜芦醇对猪卵母细胞体外发育与抗冻能力的影响及作用机理,本试验在成熟培养液中添加不同浓度的白藜芦醇,观察对卵母细胞体外成熟与发育能力的影响;利用RT-PCR技术分析成熟卵母细胞发育过程中凋亡相关基因的表达;对白藜芦醇处理前后的MⅡ期卵母细胞进行冷冻,通过对线粒体膜电位、ATP含量、ROS水平、早期凋亡和发育能力的检测,研究白藜芦醇对卵母细胞抗冻能力的影响及机制。结果表明:(1)成熟培养液中添加2到5μM白藜芦醇有利于提高猪卵母细胞体外成熟率和发育能力,提高白藜芦醇浓度至10μM则表现为细胞毒性作用;(2)添加2μM白藜芦醇可提高卵母细胞MATER(胚胎所需的母源抗原,maternal antigen that embryos require)基因表达量,并降低c-mos表达,同时它还能增加Sirt1(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,Sirt1)基因的表达,并降低凋亡相关基因的表达;当白藜芦醇添加量增至10μM时,卵母细胞凋亡相关基因的表达呈现出促凋亡状态;(3)添加白藜芦醇后,成熟卵母细胞冻后FDA染色存活率和孤雌激活卵裂率均高于未添加组,早期凋亡率则低于未添加组;(4)添加白藜芦醇后,成熟卵母细胞在冷冻前后的ROS水平均要低于未添加组,ATP含量和线粒体膜电位值则高于未添加组。综上所述,在猪卵母细胞成熟液中添加2～5μM白藜芦醇,可通过提高线粒体功能,降低促凋亡相关基因和增加抑凋亡相关基因的表达,达到提高孤雌激活胚发育、增加抗冻能力的目的;但高浓度(10μM)白藜芦醇则表现为严重的细胞毒性作用。试验五、白藜芦醇处理对猪MⅡ期卵母细胞冻后凋亡与相关基因表达的影响本试验侧重研究在冻后恢复液中添加白藜芦醇对猪卵母细胞冻后凋亡与存活率的影响,并探讨其作用机制。在猪MⅡ期卵母细胞冻后恢复液中添加2μM白藜芦醇,通过检测线粒体膜电位、ATP含量、ROS水平、凋亡状态与发育能力,以及不同凋亡途径相关基因的表达,研究白藜芦醇对猪卵母细胞抗冻能力的影响和作用机理。结果表明:(1)冻后添加白藜芦醇可显著提高线粒体膜电位水平,增加细胞内ATP含量,并降低ROS水平;(2)冻后添加白藜芦醇后,卵母细胞早期凋亡比例由46.8%下降至39.0%,总caspase水平也由未添加组的4.38下降至3.01(P<0.05);(3)冻后添加白藜芦醇可显著提高猪卵母细胞FDA染色存活率和孤雌激活胚卵裂率;(4)凋亡相关基因表达研究表明,添加白藜芦醇可提高线粒体功能相关基因(SOD1和DNM1)表达水平;并通过同时改善死亡受体介导的外源性凋亡和线粒体介导的内源性凋亡,降低细胞的凋亡水平。综上所述,在冻后卵母细胞中添加白藜芦醇可同时改善死亡受体介导的外源性凋亡和线粒体介导的内源性凋亡途径,从而减少细胞凋亡,提高冻后卵母细胞发育率。试验六、猪MⅡ期卵母细胞冻后全基因组表达谱分析用猪全基因组表达谱芯片对MⅡ期卵母细胞冷冻后基因表达谱进行分析,筛选影响卵母细胞冷冻的关键基因和相应的调控通路。结果表明:(1)猪卵母细胞玻璃化冷冻后全基因组表达谱芯片分析中共获得2倍以上差异基因171个,其中上调基因103个,下调基因68个;(2)损伤应答、细胞凋亡、程序性细胞死亡、细胞坏死及蛋白激酶调节、RNA拼接、细胞核mRNA拼接、mRNA代谢等参与了卵母细胞冻后基因差异表达的生物学过程;(3)胞外区分离、基底质膜、细胞外间隙、质膜断裂、肌动蛋白细胞骨架、线粒体断裂、线粒体、细胞器膜和线粒体包膜等参与了卵母细胞冻后基因差异表达的细胞组分调控;(4)Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和MAPK信号通路均参与了猪卵母细胞冻后基因表达的调控。