【摘 要】
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背景:结直肠癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,也是最常见的癌症相关死亡原因。早期结直肠癌的治疗以手术切除为主,化疗适用于有癌症复发风险的患者的辅助治疗。尽管近些年靶向治疗对恶性肿瘤生物学和发展的理解方面取得了进展,但由于其组织学的高度异质性,目前的治疗效果仍然有限,患者的生存时间仍然不理想,急需高效、高特异性的生物标志物和治疗靶点。因此,进一步探索新的特异性的分子并研究其在结直肠癌发生、发展及
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背景:结直肠癌是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,也是最常见的癌症相关死亡原因。早期结直肠癌的治疗以手术切除为主,化疗适用于有癌症复发风险的患者的辅助治疗。尽管近些年靶向治疗对恶性肿瘤生物学和发展的理解方面取得了进展,但由于其组织学的高度异质性,目前的治疗效果仍然有限,患者的生存时间仍然不理想,急需高效、高特异性的生物标志物和治疗靶点。因此,进一步探索新的特异性的分子并研究其在结直肠癌发生、发展及恶性生物学行为特征中的作用,对揭示结直肠癌发生发展的分子机制、预测患者生存、设计高度特异性的靶向药物,提高结直肠癌的综合治疗效果等方面具有重要意义。目的:本研究利用质谱蛋白质组学技术分析结肠癌中蛋白表达谱的变化及相关信号通路改变,深入探索结肠癌中周围神经侵犯的关键分子及其对患者预后的影响,同时联合免疫组化及公共数据库挖掘确定NENF在结肠癌中的表达变化及其临床意义。资料和方法:（1）本研究收集10对接受手术治疗且术前无抗肿瘤治疗的结肠癌组织及相对应的癌旁正常组织,依次进行组织蛋白的提取、蛋白酶切、高效液相色谱肽段分级使用非标记定量液质联用进行蛋白质表达的相对定量;（2）使用R-4.0.3软件进行蛋白组数据的标准化及缺失值处理,配对student’s t检验分析并获取差异蛋白,并进行可视化和作图;（3）利用多种生物信息学方法:包括GO、KEGG、GSEA对差异蛋白进行功能注释并探究相关分子信号通路的改变,利用STRING在线网站分析蛋白质相互作用关系（4）针对神经侵犯,对纳入的结肠癌组织进行亚组差异分析、蛋白功能注释和通路分析;（5）针对关键目标分子,下载包括TCGA和GEO在内的多个数据集mRNA表达数据并验证其转录水平的改变和对患者预后的影响;（6）选取138例具有完整预后信息的结肠癌组织并制作组织芯片,其中结肠癌组织75例,癌旁正常组织63例,利用免疫组织化学,鉴定NENF蛋白在结肠癌组织及癌旁正常组织中的表达水平;（7）本研究统计分析及作图均使用R-4.0.3软件或Prism 3.8完成。结果:1.研究纳入的10对结肠癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本经过质谱测序和预处理后,共鉴定得到9695种蛋白,利用配对t检验分析癌与癌旁组织的差异表达蛋白,以以二为底的对数转化后的差异倍数（|Log2FC|）＞1同时pvalue＜0.05作为差异分析的限制条件,最后鉴定出429个差异表达蛋白,其中333种在结肠癌组织样本中表达明显升高,96种蛋白在结肠癌组织样本中表达明显下调,KEGG分析结果显示上调的蛋白主要富集的通路包括:PI3K-AKT信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、磷脂酶D信号通路、mTOR信号通路、MAPK信号通路。2.对神经侵犯（PNI）亚组分析并计算出log2FC及p值,共有517个蛋白表达存在差异,其中447个蛋白在PNI阳性组中高表达,70个蛋白在PNI阳性组低表达。GSEA富集分析显示,相比于PNI阴性组而言,PNI阳性组主要在线粒体中的氧化磷酸化电子传递链系统、GDNF/RET信号通路、发育过程中的神经嵴细胞迁移、肿瘤中的神经嵴细胞迁移等通路中富集。3.在多个结肠癌公共数据集中验证NENF转录水平的表达变化,分析显NENF mRNA的表达在结肠癌组织中明显升高,生存分析显示较高的NENF mRNA表达与患者的预后明显相关。4.利用免疫组织化学在结肠癌组织中验证NENF的表达,发现NENF的蛋白表达在结肠癌组织中明显上调,且在Ⅲ、Ⅳ期患者中表达较高,最后生存分析显示NENF高表达的结肠癌患者总生存时间更短、预后更差。结论:利用非标定量蛋白质组学、免疫组织化学、生物信息学分析,我们发现结肠癌组织与癌旁正常组织的蛋白质表达谱具有明显差异,信号通路富集分析显示PI3K-AKT信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、磷脂酶D信号通路、mTOR信号通路、MAPK信号通路等经典信号通路在结肠癌中富集,对肿瘤的发生发展起着重要作用。针对神经侵犯亚组的差异分析显示,神经侵犯阳性亚组与神经侵犯阴性亚组在蛋白水平上有一定差异,线粒体中的氧化磷酸化电子传递链系统、GDNF/RET信号通路、发育过程中的神经嵴细胞迁移、肿瘤中的神经嵴细胞迁移等通路可能在神经侵犯阳性亚组的疾病进展中起到关键作用。同时我们发现NENF在结肠癌组织蛋白水平和mRNA水平表达明显上调,且与临床分期、PNI等病理因素相关,有希望成为预测结肠癌患者预后的生物标志物和治疗靶点。
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