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目的：研究survivin基因在肝癌组织中的表达及其临床病理意义；采用反义技术封闭survivin基因在肝癌细胞中的表达，观察其对于肝癌细胞的生长抑制作用并研究其作用机理；研究survivin基因反义寡核苷酸转染后肝癌细胞内p38MAPK与caspase-3表达与活性的变化及其相互关系，探讨survivin反义寡核苷酸对肝癌细胞生长抑制作用的信号传导途径。 方法：本实验共分三部分进行。第一部分：收集本院1994～1996年原发性肝癌手术切除标本48例，采用免疫组化及TUNEL染色方法对肝癌组织中survivin、PCNA蛋白表达及细胞凋亡进行检测，并结合临床病理特征进行分析，研究肝癌组织中survivin蛋白的表达及其临床病理意义。第二部分：针对survivin mRNA翻译起始位点设计并合成反义寡核苷酸，采用脂质体介导转染人肝癌细胞系SMMC-7721，采用western blot、免疫组化及原位杂交方法检测survivin反义寡核苷酸对7721细胞survivin蛋白及mRNA表达的作用。测定转染前后细胞增殖活性变化，绘制细胞生长曲线，研究survivin反义寡核苷酸对7721细胞的生长抑制作用。在此基础上，采用透射电镜观察细胞超微结构变化，流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统的改变，进一步研究survivin反义寡核苷酸对7721细胞的生长抑制效应。第三部分：采用流式细胞仪检测细胞周期的变化，RT-PCR方法检测细胞内cyclinB1 mRNA表达的变化；采用western blot、免疫沉淀、RT-PCR及激酶活性检测方法检测转染前后细胞内p38MAPK及caspase-3表达及活性的变化，应用p38MAPK特异性抑制剂SB202190研究p38MAPK及caspase-3活性变化的关系，探讨survivin 反义寡核着酸抑制肝癌细胞生长的作用机制及其相关信号转导途径。 结果：l、48例肝癌组织中有 31例 survivin蛋白表达阳性，阳性率 64．6％。Survivin在肝癌组织中的表达与肿瘤分化程度有关，与其余临床病 理特征无关。在Edmondson分级I～11级患者其表达显著低于Ill—IV级患 者。2、肝癌组织中survivin表达与细胞增殖凋亡比有关，survivin表达阴 性者肝癌细胞增殖凋亡比显著低于表达阳性者。Survivin表达阴性患者与 表达阳性者比较，其一年生存率无显著差异，但三年生存率显著高于后者。 3、脂质体介导survivin反义寡核苦酸转染人肝癌SMMC．7721细胞后，细 胞内survivin蛋白及mRNA表达显著降低；同时细胞贴壁率显著降低，细 胞生长明显受抑制，生长抑制率最高可达对．82％，至转染后一周仍可维持 一定的生长抑制作用。4、透射电镜观察可见转染后细胞超微结构呈凋亡样 改变，如染色质浓缩、断裂及凋亡小体形成等。激光共聚焦显微镜观察发 现转染后细胞骨架微丝系统发生了剧烈的变化，微丝失去了其均匀致密排 列有序的结构，或发生断裂，其平均荧光强度显著降低。5、流式细胞仪检 测见转染后细胞凋亡显著增加，并出现GZ／M期阻滞现象。RT－PCR检测发 现转染后细胞内 cyclinB m删A含量显著增加。6、正常 7721细胞中 p3 SMAPK和caspase上有一定量的基础表达，但其活性很低，survivin反 义寡核苦酸转染对其表达无明显影响，但转染后P38MAPK及caspase上活 性均显著升高，其中p38MAPK活性升高发生于caspase上活性升高之前， 应用特异性p38MAPK活性抑制剂SB202190作用后可以显著抑制 p38MAPK及caspase－3的活性。 结论：l、SSrvivin在肝癌组织中的表达具有普遍性，其表达与 Edmondson分级及肝癌细胞增殖凋亡比有关，survivin的表达对促进肝癌 细胞增殖、抑制其凋亡具有重要作用，同时survivin的表达也可作为预后 不良的重要指标。2、脂质体介导转染针对 survivin mRNA启动子区的反义 寡核着酸可在蛋白及 mANA两个水平上有效地降低肝癌 SMMC－772细胞 内survivin的表达，并能够有效抑制肝癌细胞的增殖活性，survivin可以作 为肝癌治疗中具有重要作用的靶点。3、survivin表达下调对肝癌细胞的 Vll生长抑制作用主要通过诱导细胞发生凋亡以及阻止有丝分裂的完成而实现。封闭S［lfVIVill的表达可以引起细胞骨架微丝系统破坏，导致细胞发生凋亡；还可以引起 CyClinBI表达增加导致细胞无法完成有丝分裂，发生G／M期阻滞，并进一步发生凋亡。4、原发性肝癌组织细胞中p38MAPK及caspase上多以无活性状态存在。肝癌细胞转染survivin反义寡核着酸后，首先激活p38MAPK信号途径，活化的p38MAPK信号途径引起下游的caspase上的活化是导致肝癌细胞发生凋亡的关键因素。