肌内脂肪含量高低和肉品的嫩度、风味与多汁性等密切相关,然而长期以来追求高瘦肉率的育种目标导致猪肌内脂肪含量显著降低,使得商品猪肉的品质不断下降。随着民众生活水平的日益提高,人们对优质猪肉的需求也越来越高。为了改善不断下降的猪肉品质,在不影响背膘厚的情况下适度地提高猪肌内脂肪含量已成为当前猪育种的主要目标之一。前人研究表明机体不同部位的脂肪沉积存在差异,但是猪皮下与肌内脂肪差异性沉积的分子调控机制尚不完全清楚。因此,通过对比皮下和肌内脂肪基因表达谱,筛选两者的差异基因、信号通路来寻找特异调控肌内脂肪沉积的潜在靶点,对于完善猪肌内脂肪特异性沉积的调控网络具有重要意义,也将为提高猪肉品质奠定坚实的理论基础。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员,PPARs可分为α、β/δ和γ三种类型,其中PPARγ主要表达于脂肪组织,是调控脂肪细胞形成和维持成熟脂肪细胞功能的主要转录因子。前人研究发现在猪、小鼠和人上,PPARγ激活剂会显著增加肌内脂肪含量,而对总体脂含量没有显著影响。我们通过对皮下和肌内脂肪细胞的转录组测序也发现PPAR信号通路存在显著差异。因此,推测激活PPAR信号通路可能会对猪皮下和肌内脂肪细胞增殖分化过程产生不同的作用。为了验证此假设,本实验利用流式细胞术、油红O染色、Real-time PCR和Western Blot等分子生物学技术,检测了激活PPARγ对猪皮下和肌内脂肪细胞形态和基因表达以及增殖、分化相关信号通路的影响。此外,借助高通量转录组测序技术,明确了激活PPARγ对猪皮下和肌内脂肪细胞分化的不同作用机制。本研究获得的主要结果如下:1.体外分离培养小鼠皮下脂肪细胞,激活PPARγ能够上调产热基因(Ucp1,...)以及线粒体生成相关基因(Cidea,...)的表达。2.采用高通量转录组测序技术,在分化成熟的猪皮下和肌内脂肪细胞之间鉴定出了1051个差异表达基因,其中PPARγ在皮下脂肪细胞中的表达水平显著高于肌内脂肪细胞,对差异基因KEGG通路富集分析显示PPAR信号通路的富集指数(Enrichment factor)最高。3.PPARγ激活剂处理猪皮下和肌内前体脂肪细胞后,CCK8、流式细胞周期检测、EdU检测、细胞周期基因(CyclinB和CyclinD)表达及增殖关键信号通路Erk的变化差异均不显著(P≥0.05),说明激活PPARγ不影响猪原代皮下和肌内脂肪细胞的增殖。4.在脂肪细胞分化过程中,激活PPARγ可极显著促进猪肌内脂肪细胞的分化,油红O染色定量结果显示处理组为对照组的1.62倍(P<0.01),虽然激活PPARγ对猪皮下脂肪细胞分化也有促进作用(1.27倍),但油红O定量统计结果显示差异不显著(P≥0.05)。5.分别对PPARγ激活剂处理的分化期猪皮下脂肪细胞和肌内脂肪细胞进行高通量转录组测序,结果发现猪皮下脂肪细胞发生显著变化的基因有165个,而肌内脂肪细胞发生显著变化的基因仅有83个,提示激活PPARγ对猪皮下和肌内脂肪细胞的基因表达谱产生了不同的影响。6.进一步对显著差异的基因进行KEGG通路富集分析,激活PPARγ均显著改变了分化期猪皮下和肌内脂肪细胞的PPAR信号通路,差异基因在PPAR通路的富集水平在肌内脂肪细胞中要高于皮下脂肪细胞。值得注意的是,猪肌内脂肪细胞在PPARγ激活剂处理后AMPK信号通路也被显著激活,而皮下脂肪细胞AMPK信号通路无显著变化,Western Blot检测结果也与测序结果一致,证明PPARγ可能通过差异性调控AMPK信号通路影响猪肌内脂肪细胞分化。7.采用PPARγ激活剂处理分化成熟的肌细胞(肌管),然后收集培养基,使用该培养基处理脂肪细胞,结果显示处理组与对照组相比成脂基因无显著差异,揭示PPARγ可能不通过影响肌细胞分泌因子间接影响肌内脂肪细胞分化。综上所述,首先通过转录组测序技术筛选得到猪皮下和肌内脂肪细胞差异基因PPARγ和差异信号通路PPAR信号通路,因此推测PPARγ可能在皮下和肌内脂肪细胞增殖分化过程中存在不同的作用。通过实验发现激活PPARγ不会对猪皮下和肌内脂肪细胞增殖产生影响,但显著促进了肌内脂肪细胞成脂分化。对PPARγ激活剂处理的分化期猪皮下和肌内脂肪细胞再次进行高通量转录组测序,差异基因KEGG通路富集结果显示PPARγ激动剂特异激活肌内脂肪细胞AMPK信号通路,而对皮下脂肪细胞AMPK通路无显著影响。此外,发现激活肌细胞PPARγ不会通过改变肌细胞分泌因子间接影响肌内脂肪细胞分化。本研究提示猪皮下和肌内脂肪细胞的PPAR信号通路存在显著差异,这种内在的差异导致激活PPARγ对两者分化产生了不同的作用,这为靶向PPAR信号通路差异调控猪皮下和肌内脂肪沉积提供了理论依据。