论文部分内容阅读
背景及目的: 遗传性脊髓小脑共济失调（hereditary spinocerebellar ataxia，SCAs）是以小脑机能障碍为主要临床特征的运动失调性疾病，占神经系统遗传性疾病的10％～14％。SCAs发病年龄多为青壮年，亦有报道幼儿和老年发病者，病情进展缓慢，逐渐加重，伴有复杂的小脑症状和非小脑表现。根据其遗传方式、基因突变和生化代谢产物不同等将SCAs分为SCA1-SCA45型（见表8 ） ，其中大多数是SCA3、2、1、7和SCA8表型，其余表型相对少见，如SCA42、ADCADN和脑白质病变及髓鞘形成不足等表型，仅在部分国家、地区报道过。 高度临床及异质性是SCAs的主要遗传学特征，各表型之间的临床表现极为相似又有各自特征，错综复杂，又易与其他神经系统疾病相互重叠，仅仅依靠其病史、临床症状、体征和CT、MRI等影像学检查进行确诊及分型十分困难；SCAs的确诊及各表型区分应进行分子遗传学和分子生物学检查，到目前为止，基因测序分析已经成为SCAs乃至神经系统遗传性疾病确诊的金标准。目前在河南省郑州及开封地区有一个遗传性脊髓小脑共济失调-汉族家系，人口基数大，发病人数多，多于30～40岁发病，病情进展有快有慢，呈逐渐加重，以小脑性运动机能障碍为主要临床特征，伴有复杂的小脑症状和非小脑表现；其子代里将近有一半发病，每代都有发病者，发病者的父母其中之一是患者，性别无显著差异，符合常染色体显性遗传方式，较高的致愚、致残率及到目前为止的不可彻底治愈性，严重影响患者的生活质量，给患者造成躯体运动障碍和巨大的情感压力，给社会、家庭带来沉重的经济负担。针对此家系进行研究，具体方法与结果如下。 方法: 首先评估此家系内各个发病者的临床表型，进行家系调查、系谱绘制和分析，采集家系内成员和对照组血液样本并提取DNA，参照文献和SCA各表型在国外和国内的发病率高低，结合该家系的临床特征，通过PCR对常见、多发的SCAl、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17和DRPLA基因的三核苷酸（ CAG ）重复片段进行扩增，然后行基于毛细管电泳的STR（SHORT TANDEM REPEATS）微卫星检测和应用2%琼脂糖凝胶进行电泳等基因测序分析方法确定等位基因片段内三核苷酸CAG正常及异常重复拷贝次数。 具体步骤如下： 先将先证者SN004和家系内有临床表型者SN001、SN019、SN021及SN037成员与对照者 N012 的 DNA 依次与 SCAl、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17和DRPLA基因引物序列（5’端加用FAM修饰）进行PCR，扩增产物送上海生物工程有限公司行基于毛细管电泳的STR微卫星检测；测序分析结果发现先证者SN004和SN001、SN019、SN021、SN037与对照者N012相比，SCA6 PCR扩增明显异常，异常等位基因碱基个数均是171bp（如图6），扩增次数为23次，另一等位基因碱基个数依次为132 bp（10次）、138 bp（12次）、135 bp（11次）、138 bp （12次）、138bp（12次），在正常范围之内（4-17次）；而对照者N012等位基因碱基个数为118 bp、132bp（如图7），重复次数为5、10次， 并且SCAl、SCA2、SCA3、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17和DRPLA等位基因扩增正常，诊断为遗传性脊髓小脑共济失调6型（ SCA6 ）。再将先证者SN004和SN001、SN019、SN021、SN037与对照者N012的DNA ，与SCA6基因引物序列进行PCR之后应用2％（注200bp碱基以下应用2%）琼脂糖凝胶进行电泳，结果发现先证者SN004和SN001、SN019、SN021、SN037出现异常条带，异常条带等位基因扩增明显（片段长度相当于171bp ） ，而对照者N012无此异常条带，而另一条带等位基因扩增与对照者N012 PCR产物长度大致相同（如图8），再次证明该研究家系系遗传性共济失调-脊髓小脑型6型（SCA6）。 先证者SN004和SN001、SN019、SN021、SN037的三核苷酸（CAG）拷贝次数相对较少，在亲-子传递及家系成员中都保持相对稳定，后代的拷贝序列长度也很少发生变异，均为23次，可见先证者及家系内患者的遗传学分析也与SCA6表型吻合。对家系内所有成员和对照组的DNA经SCA6 PCR扩增后产物送上海生物工程有限公司行基于毛细管电泳的STR微卫星检测，对其结果进行分析并获得等位基因片段CAG重复拷贝次数。 结果: 本研究家系中先证者（SN004）及有症状成员表现出头晕、小脑性语言、上肢持物不稳、躯干及下肢行走不稳等运动机能障碍，对此家系所有成员行基因测序分析发现突变基因携带者16人，10男6女，有临床表型10人，另有6名无症状成员。其中一条等位基因片段扩增显著异常，经DNA测序分析三核苷酸（CAG）重复拷贝次数均是23次，对应碱基个数约为171bp，另一条等位基因片段扩增正常，CAG重复拷贝次数在文献报道的正常范围内，5-12次，对应碱基个数约为118-138bp；均为杂合突变。 结论: 1.该研究家系经基因测序分析诊断为常染色体显性遗传-脊髓小脑性共济失调6型（SCA6），突变基因携带者16人，其中有临床表型10人，另有6名无症状成员。 2.基于毛细管电泳的STR微卫星检测技术在实验室和临床的广泛应用，大规模、批量标本的检测得以实现，使得基因诊断更准确、快捷方便、经济。