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背景:在全世界范围内乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者超过3亿,每年约有100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。目前,已批准的治疗HBV的药物主要基于干扰素和核苷类似物。然而,长期使用与患者发生耐药突变和肝纤维化/肝硬化的风险相关。并且,这些药物不能靶向或消除HBV共价闭合环状DNA（ccc DNA）。HBV ccc DNA的完全消除是完全治愈乙型肝炎病毒感染的关键。目前,对HBV ccc DNA靶向治疗的研究主要集中在两个方面,一是抑制ccc DNA的形成,二是消除ccc DNA。有研究表明,CRISPR/Cas9系统可以直接破坏HBV ccc DNA,这为完全治愈乙肝提供了一种全新的策略。然而,目前缺乏一种高效率、低免疫原性的CRISPR/Cas9递送系统,以及如何对CRISPR/Cas9实施精准的远程时空操作是研究人员面临的主要问题。目的:1.制备近红外响应的仿生纳米粒子（UCNPs-Cas9@CM）并对其进行表征,为其应用于HBV治疗奠定基础。2.对近红外响应的仿生纳米粒子UCNPs-Cas9@CM进行性能验证,为进一步评估其在细胞和动物水平治疗HBV提供依据。3.在体外研究UCNPs-Cas9@CM对HBV的治疗效果。4.在体内研究UCNPs-Cas9@CM对HBV的治疗效果。方法:1.采用溶剂热法制备了Na YF4:Yb/Tm/Ca@Na YF4:Nd/Yb核壳型上转换纳米粒子（UCNPs）,随后通过聚丙烯酸（PAA）对UCNPs进行处理后得到了水溶性羧基功能化纳米颗粒（UCNPs-PAA）。将UCNPs-PAA通过酰胺键偶联到亲和素蛋白上,得到UCNPs-Avidin纳米粒子。对Cas9/sg RNA进行体外切割HBV ccc DNA的活性检测,筛选出剪切效率最高的sg RNA。由于亲和素和生物素之间天然的高亲和力作用,可光解的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯（PCB）可以很容易地结合UCNPs-Avidin形成UCNPs-Avidin/PCB纳米颗粒。UCNPs-Avidin/PCB与Cas9蛋白进行共价偶联,随后再与sg RNA孵育,形成仿生纳米粒子的内核（UCNPs-Cas9）。然后提取HBV复制肝癌细胞模型的细胞膜,将提取的细胞膜与先前制备的UCNPs-Cas9混合,通过聚碳酸酯滤膜反复挤压,得到最终所需的仿生纳米粒子UCNPs-Cas9@CM。最后检测UCNPs-Cas9@CM的形貌、粒径、Zeta电位、荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、和细胞膜蛋白等表征。2.通过q RT-PCR检测细胞内炎性因子m RNA的水平对UCNPs-Cas9@CM进行生物相容性评估;连续7天检测UCNPs-Cas9@CM在PBS溶液中的粒径大小以评估其胶体稳定性;在细胞水平通过流式细胞仪和激光共聚焦检测UCNPs-Cas9@CM的同型靶向性和免疫逃逸性能;用808 nm波长的激光器研究了对Cas9/sg RNA的释放情况。3.首先评估了NIR响应的光热特性对细胞活力的影响,然后利用CCK-8法对UCNPs-Cas9@CM进行细胞毒性评估;通过T7E1酶切检测了UCNPs-Cas9@CM是否能有效地破坏细胞模型中的HBV ccc DNA;分别用PBS和UCNPs-Cas9@CM处理细胞,检测HBV ccc DNA、HBV pg RNA、HBV DNA、HBs Ag、HBe Ag等指标的变化;通过Sanger测序检测UCNPs-Cas9@CM在体外清除HBV的过程中是否存在脱靶效应。4.在体内实验中提取小鼠肝细胞膜制备UCNPs-Cas9@CM。首先通过ICP-MS和生物发光成像验证UCNPs-Cas9@CM在体内的归巢能力。再通过溶血试验评估UCNPs-Cas9@CM在体内应用的安全性。随后将HBV转基因小鼠随机分为三组,分别用PBS,UCNPs-Cas9和UCNPs-Cas9@CM处理并每2天监测一次小鼠体重。注射后第14天处死小鼠,检测小鼠的血液学参数,血清中HBV DNA、HBs Ag和HBe Ag水平,以及肝细胞中HBs Ag和HBc Ag水平。同时将小鼠主要器官做组织学分析评估纳米粒子在体内的毒性。为了进一步分析UCNPs-Cas9@CM在体内的排泄,使用ICP-MS测量粪便和肾脏排泄的镧系离子(Y3+)浓度。最后,使用从小鼠肝脏中提取的基因组DNA来评估脱靶效应,并通过T7E1检测验证预测的含有脱靶位点的PCR扩增产物。结果:1.从已发表的文献中选择了3条HBV特异性g RNA,体外裂解实验结果显示,sg RNA17对HBV基因的靶向性优于其他sg RNA。透射电子显微镜（TEM）显示UCNPs-Cas9@CM为典型的核-壳结构,壳层厚度约为10 nm。扫描电子显微镜（SEM）显示UCNPs-Cas9@CM的形态呈规则球形,大小均一,且分散性良好。布鲁克海文粒度分析仪测得UCNPs-Cas9@CM粒径约为133.34±2.31 nm,Zeta电位约为-26.34±1.32 m V。通过考马斯亮蓝染色和Western Blot分析可以看到UCNPs-Cas9@CM广泛保留了源细胞膜的膜蛋白,并且存在与单体亲和素和Cas9蛋白对应的蛋白条带。2.UCNPs-Cas9@CM生物相容性和胶体稳定性良好,无明显的细胞毒性,并且具有较高的靶向特异性和免疫逃逸能力。此外,在808 nm激光仪辐照条件下可通过断裂PC linker有效的释放Cas9/sg RNA,Cas9在核定位信号（NLS）和sg RNA的引导下进入细胞核发挥基因编辑作用。3.我们在实验过程中使用了短时间间隔辐照（照射1min,停止2min）来避免NIR响应的光热特性对细胞造成的损伤。CCK-8结果显示UCNPs-Cas9@CM对细胞活力没有显著影响,T7E1实验结果显示UCNPs-Cas9@CM在体外具有良好的基因编辑效率。我们评估了网站预测的sg RNA17在人基因组中前几个最可能的脱靶位点,结果显示UCNPs-Cas9@CM在体外没有发现脱靶效应。与对照组（PBS组）相比,UCNPs-Cas9@CM处理细胞后,HBV 3.5kb RNA、细胞内HBV DNA、HBV ccc DNA和HBV病毒抗原显著降低。4.在体内研究中,UCNPs-Cas9被小鼠肝细胞膜片段包裹,形成UCNPs-Cas9@CM纳米颗粒。ICP-MS分析和生物发光成像结果显示,细胞膜功能化的UCNPs-Cas9@CM主要分布在肝脏中,表明UCNPs-Cas9@CM在体内具有良好的归巢能力。溶血试验结果显示经不同浓度的UCNPs-Cas9@CM处理后,未出现溶血现象。与UCNPs-Cas9组相比,UCNPs-Cas9@CM组显著降低了血清中HBV DNA、HBs Ag和HBe Ag水平,以及肝细胞中HBs Ag和HBc Ag水平。然而,各组小鼠在血液参数、体重上和各器官的HE染色结果上并没有显著差异。这些结果证实了UCNPs-Cas9@CM具有良好的同型靶向性和生物相容性,且无全身毒性作用。小鼠尿液和粪便中Y3+水平随时间的推移而稳步下降,提示UCNPs在体内被有效的排泄。此外,T7E1实验结果显示没有检测到脱靶效应。结论:1.我们成功的制备了近红外响应的仿生纳米粒子UCNPs-Cas9@CM。该纳米粒子粒径均一,在水中分散性良好,载有Cas9/sg RNA核糖核蛋白复合物,包覆的细胞膜碎片保留了同源细胞表面的膜蛋白,可高效靶向同源细胞。2.制备的仿生纳米粒子UCNPs-Cas9@CM具有良好的生物相容性、同型靶向性和免疫逃逸能力。UCNPs-Cas9@CM也表现出良好的稳定性,水动力学直径变化在7天内几乎恒定,并可在808 nm激光仪激发下有效释放Cas9/sg RNA发挥基因编辑作用。3.UCNPs-Cas9@CM在体外研究中显示了良好的抗HBV治疗效果。4.UCNPs-Cas9@CM在体内研究中显示了良好的抗HBV治疗效果。