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目的:
葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)是热休克蛋白70家族的成员之一，作为一种分子伴侣蛋白参与了蛋白质的折叠和转运，也是内质网上的一种应激蛋白，在低糖、低氧、低Ca2+等应激状态下大量表达以维持内质网的稳定，保护细胞。近年研究表明GRP78在某些肿瘤细胞中呈高表达，提示其在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，并与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性有关。钙网蛋白(calreticulin，CRT)是热休克蛋白家族成员之一，能调节细胞多种生理功能，如作为凝集素样分子伴侣，协助蛋白质正确折叠、抗原的提呈、维持细胞Ca+稳态、参与细胞粘附、调节细胞凋亡、抑制血管生成以及自身免疫等。最近研究发现，CRT与肿瘤的发生，诊断、预防、治疗及预后密切相关。目前研究显示GRP78、CRT在众多肿瘤的发生中起着重要作用，但目前国内外关于GRP78、CRT与外阴疾病的关系尚少有报道，因此本研究将检测外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中GRP78及CRT的表达情况，探讨其与外阴疾病之间的关系。
材料及方法:
一、材料
1、标本
选自中国医科大学附属第一医院妇科经手术或活检切除的30例外阴鳞状细胞癌组织，20例外阴硬化性苔藓组织，10例外阴正常皮肤组织做对照。标本的一部分存入-80℃冰箱冻存，用于蛋白免疫印记实验，另一部分经福尔马林固定，石蜡包埋，用于免疫组化实验。所有患者病理资料完整，标本均经病理学证实，均未行放化疗及激光等物理治疗。
2、试剂
兔抗人GRP78多克隆抗体购自Abcam公司，兔抗人CRT多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruze公司。S-P免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，ECL试剂及BCA定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
二、实验方法
采用免疫组织化学方法及Western blot技术分别检测外阴正常组织、外阴硬化性苔藓及外阴鳞癌中GRP78及CRT的表达情况。
三、结果判定
在光学显微镜下观察以细胞浆或细胞核出现黄色或棕黄色颗粒者为阳性，应用显微图像分析系统Meta Morph(UIC/OLUMPUS.US/JP)进行积分光密度测定，每张切片表皮层5个不同高倍视野，计算同一张切片的平均积分光密度值。Westernblot结果用Quantity One软件用于半定量分析特异性条带的灰度值，与内参的灰度值的比较值为蛋白的相对含量。
四、统计学处理
所有数据资料用SPSS17.0进行处理，各组计量资料的结果采用t检验，用均数±标准差的方式进行统计描述，P＜0.05有统计学意义。应用Pearson相关分析法分析GRP78与CRT之间的相关性。
实验结果:
一、western blot检测结果
在外阴正常皮肤与外阴鳞癌中GRP78的平均灰度值比值分别为0.34±0.11，0.66±0.21，两者有显著性差异(P＜0.05)。在外阴正常皮肤及外阴鳞癌中CRT的平均灰度值比值分别为0.65±0.17，0.84±0.15，两者有显著性差异(P＜0.05)。
二、免疫组化检测结果
1、GRP78蛋白在外阴不同组织中的表达情况
GRP78蛋白表达于细胞浆，呈棕黄色颗粒。在外阴正常皮肤阳性细胞位于表皮全层，多在基底细胞层，呈细胞浆阳性，真皮中表达少（图1），阳性细胞的平均光密度值为0.3316±0.006;在外阴硬化性苔藓中阳性细胞位于表皮全层（图2），表达阳性细胞的平均光密度值为0.3381±0.0169，两者无显著性差异(P＞0.05)。在外阴鳞状细胞癌的癌巢中有阳性细胞表达，间质细胞较少（图3），阳性细胞的平均光密度值为0.3585±0.0062，与正常皮肤相比有统计学上的差异(P＜0.05)。
2、CRT蛋白在外阴不同组织中的表达情况
CRT蛋白表达于细胞膜、细胞核及细胞浆，呈棕黄色颗粒。在外阴正常皮肤阳性细胞位于表皮全层，主要是细胞核阳性（图1）。阳性细胞的平均光密度值为0.2847±0.0043;在外阴硬化性苔藓中阳性细胞位于表皮全层下1/2，表现为细胞膜阳性（图2），阳性细胞的平均光密度值为0.2890±0.0163，两者无显著性差异;在外阴鳞状细胞癌的癌巢中有阳性细胞表达，呈细胞核/浆阳性，而间质中无表达(图3)，阳性细胞的平均光密度值为0.2962±0.0126，与正常皮肤相比有统计学上的差异(P＜0.05)。
三、GRP78、CRT在外阴鳞癌中的相关性
Pearson相关分析显示:GRP78和CRT在外阴鳞癌中表达量呈正相关(R2=0.583，P＜0.001)。
结论:
1、外阴鳞状细胞癌中GRP78高表达。
2、外阴鳞状细胞癌中CRT高表达。
3、GRP78和CRT在外阴鳞癌中的表达呈正相关。