西瓜（Citrullus lanatus L.）是一种世界性瓜类蔬菜作物,因富含类胡萝卜素而具有丰富瓤色,且味甜多汁、食用方便,深受广大消费者喜爱,具有重要经济价值。不同西瓜品种果实中类胡萝卜素组成和含量的多样性导致果肉呈现不同瓤色。本研究通过研究类胡萝卜素代谢途径基因及其编码蛋白的功能,探讨西瓜果肉颜色形成遗传育种机理,为西瓜瓤色分子遗传育种提供理论基础。研究前期以红色果肉西瓜LSW-177与浅黄色果肉西瓜Cream of Saskatchewan（简称为“COS”）为亲本材料,进行遗传连锁和QTL分析,确定番茄红素β-环化酶（LCYB）基因是决定西瓜果肉红与非红的关键基因。在类胡萝卜素代谢途径中,番茄红素β-环化酶是将番茄红素环化为β-胡萝卜素的关键酶,该酶的活性与西瓜果肉颜色形成密切相关。研究发现,该基因以单拷贝的形式存在于西瓜基因组中。本研究分别从LSW-177和COS材料中克隆得到西瓜番茄红素β-环化酶基因Cllcyb-177和Cllcyb-cos,序列分析显示这两个基因存在三个核苷酸差异,导致编码的蛋白质序列中226（Phe/Val）和435（Lys/Asn）发生变异。生物信息学分析显示在高等植物中LCYB蛋白226位置氨基酸高度保守,均为Phe。利用类胡萝卜素工程菌的颜色互补试验和高效液相色谱（HPLC）对两个LCYB基因编码的酶活性进行鉴定,结果表明在原核表达系统中Cllcyb-177和Cllcyb-cos蛋白都具有生物活性,能够高效地将番茄红素环化为β-胡萝卜素,且无显著差异;对Cllcyb蛋白序列中部分氨基酸进行点突变,其酶活力发生显著变化,具体表现为:Cllcyb蛋白序列中Ala168突变为Glu168会导致蛋白丧失环化酶活力;Cllcyb蛋白序列中Phe190-Ile208突变为Leu190-Phe208时,同样会导致Cllcyb蛋白丧失环化酶活力,而将Cllcyb蛋白序列中突变为Leu190-Phe208后,Phe226会使得Cllcyb蛋白环化能力恢复80%;Cllcyb蛋白序列中Pro349-Thr376突变为Ser349-Aln376会使得Cllcyb蛋白的环化能力丧失70%。这为研究氨基酸位点对于西瓜LCYB酶功能的影响提供了基础,同时为通过改变LCYB酶活性以达到改良西瓜果实中番茄红素和β-胡萝卜素含量提供了新的思路。番茄红素环化酶LCYB和LCYE共同作用可以将番茄红素环化为α-胡萝卜素。利用类胡萝卜素工程菌的颜色互补试验和高效液相色谱（HPLC）对西瓜番茄红素环化酶另一个成员LCYE功能进行鉴定。结果表明:转基因菌株菌体颜色未发生改变,在原核表达系统中Cllcye酶活性较弱,仅能将微量的番茄红素环化为δ-胡萝卜素。通过染色体步移技术分别克隆得到西瓜材料LSW-177中番茄红素环化酶Cllcyb基因启动子1,775 bp和COS材料Cllcyb基因启动子1,644 bp。比对结果显示,两份材料的Cllcyb基因启动子仅有部分序列（-895～+1）完全相同;Plant CARE软件分析表明,这两个启动子序列均含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件,同时含有光响应、昼夜节律、茉莉酸甲酯及赤霉素元件等应答元件;同时,在LSW-177材料的Cllcyb基因启动子区域发现特有的AT-rich元件,而COS材料的Cllcyb基因启动子则为水杨酸响应元件TCA-element。为进一步研究两份材料Cllcyb基因启动子活性,分别构建了LSW-177材料Cllcyb基因启动子全长、COS材料Cllcyb基因启动子全长、Cllcyb基因启动子共有序列以及COS材料Cllcyb基因启动子5’缺失片段,驱动GUS基因的植物表达载体P177、Pcos、P3、C1和C2。瞬时转化烟草叶片发现,C1、C2、Pcos均有启动子活性且Pcos活性强于C1和C2,但P177和P3几乎不能驱动GUS基因表达。结合启动子活性试验结果以及Cllcyb基因在LSW-177和COS西瓜果实发育中表达结果,我们推测Cllcyb基因在红色西瓜LSW-177和浅黄色西瓜COS果肉中参与不同调控网络。研究显示,多个关键基因参与植物类胡萝卜素代谢途径。我们利用葫芦科基因组数据库信息分别从西瓜材料LSW-177和COS中克隆得到八氢番茄红素合成酶基因（Cl PSY1、Cl PSY2和Cl PSY3）、ξ-胡萝卜素脱氢酶基因（Cl ZDS）、类胡萝卜素异构酶基因（Cl CRTISO-1和Cl CRTISO-2）和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因（Cl NCED1、Cl NCED2和Cl NCED3）以及与类胡萝卜素质体储存相关基因Cl OR（富含半胱氨酸的锌指结构域蛋白基因）。序列分析显示COS材料中Cl PSY1基因编码区缺失23nt,导致移码突变,不能编码连续完整蛋白质,Cl PSY2在LSW-177和COS材料中存在一个核苷酸变异,导致一个氨基酸变异,而两份材料Cl PSY3基因编码区序列一致。在LSW-177和COS材料中扩增得到一个新的Cl ZDS转录本（比参考序列多了一个外显子）,两份材料Cl ZDS基因编码区发现6个核苷酸变异,导致其编码的蛋白质序列中3个氨基酸位点发生改变。在LSW-177和COS材料中扩增得到两个新的Cl CRTISO转录本Cl CRTISO-1和Cl CRTISO-2,其中Cl CRTISO-1为1,402 bp,编码466个氨基酸（+2）,5’端序列不完整;Cl CRTISO-2为1,746 bp,不能够编码完整蛋白质。在西瓜LSW-177和COS材料中,克隆得到Cl NCED1基因编码区中发现3个单核苷酸变异,导致编码的605个氨基酸中2个氨基酸位点突变;Cl NCED2基因编码区存在8个核苷酸变异,导致5个氨基酸位点发生突变;Cl NCED3基因编码区仅有一个核苷酸变异,导致其编码的蛋白质序列中存在一个氨基酸突变。在西瓜LSW-177和COS材料中克隆得到一个新的Cl OR基因转录本（与参考序列相比缺少8号外显子）,两份材料的Cl OR基因非常相似,仅一个核苷酸888（C/T）突变,不导致氨基酸变异。保守结构域分析表明这些基因编码的蛋白质均为典型类胡萝卜素家代谢途径蛋白,在植物中高度保守。