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第一部分脑源性神经营养因子在多发性骨髓瘤患者血浆中的表达目的:研究多发性骨髓瘤(MM)患者血浆中脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达情况及与相应临床检测指标的关系,初步探讨BDNF在多发性骨髓瘤的发生与发展中的作用。方法:用酶联免疫吸附试验( ELISA)测定MM患者与健康体检者血浆BDNF、VEGF的浓度,同时观察MM患者血常规、肾功能、电解质、影像学等指标。结果:患者血浆BDNF浓度为(4. 22±0. 64)×103 pg/ml,与健康体检者(2. 03±0. 38)×103 pg/ml比较,差异有统计学意义( P < 0. 05);患者血浆VEGF浓度为(79. 35±13. 25) pg/ml,与健康体检者(34. 41±1. 78) pg/ml比较,差异有统计学意义( P < 0. 01)。BDNF与VEGF水平间存在着相关性( r =0. 430 , P = 0. 025)。结论:MM患者血浆BDNF和VEGF显著增高,BDNF可能是继VEGF后又一促进血管增殖活性的细胞因子。第二部分多发性骨髓瘤细胞激活共培养内皮细胞脑源性神经营养因子自分泌环目的在体外共培养体系中研究人MM细胞对正常内皮细胞的作用。方法建立人MM细胞株RPMI8226与正常人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的体外共培养体系;以同期单独培养的HUVECs为对照,对与RPMI8226共培养的HUVECs进行BDNF及其特异性受体TrkB基因的半定量RT-PCR分析和蛋白的Western blot分析,采用ELISA的方法检测共培养体系培养上清中BDNF的含量;在转换共培养实验的基础上应用Transwell小室迁移实验、网状结构形成实验评价RPMI8226细胞共培养激活的HUVECs对正常HUVECs血管新生能力的影响。结果与同期单独培养的HUVECs相比,经共培养后的HUVECs不仅上清中BDNF的含量增加[分别为(12.4±5.1)×103 pg/ml和(31.6±7.2)×103 pg/ml,P < 0. 05],而且RT-PCR结果显示HUVECs常规表达BDNF,与RPMI8226共培养后HUVECs BDNF表达量约为前者的1.7倍(P < 0. 05);而单独培养的HUVECs几乎不表达TrkB,共培养的RPMI8226明显上调其TrkB的表达(为4.4倍,P < 0. 05),Western blot结果与上述结果相符;经RPMI8226活化的内皮细胞可明显促进HUVECs迁移和网状结构形成,与未活化的内皮细胞相比迁移指数和网状结构数量分别增加了99%和72%,抗BDNF抗体可部分抑制其活性。结论MM细胞通过可溶性的细胞因子介导,激活内皮细胞的BDNF /TrkB自分泌环,继而实现内皮细胞的自促进血管新生效应。第三部分AKT/eNOS信号通路在BDNF诱导内皮细胞血管新生中的作用目的探讨BDNF促进内皮细胞血管新生的机制及其参与的信号通路,为抗多发性骨髓瘤血管生成的研究提供新的实验依据。方法以HUVECs为对象,采用Western印迹方法检测细胞内磷酸化丝/苏氨酸激酶(AKT)、内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)蛋白质的表达;采用Transwell小室迁移实验、网状结构形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力,小鼠体内Matrigel plug实验评估体内内皮细胞血管新生的能力,采用硝酸还原酶法检测HUVECs上清中内皮细胞源性一氧化氮(eNO)的含量,FITC-Annexin-Ⅴ/ PI双染流式细胞术分析细胞凋亡。结果BDNF以时间-浓度依赖性的方式激活PI3K/ Akt/eNOS信号通路,应用PI3K激酶抑制剂Ly294002可以明显阻断BDNF刺激后内皮细胞eNO的生成。在体外,BDNF诱导的细胞迁移和网状结构形成效应均分别能被Ly294002和L-NAME(NOS抑制剂)阻断;而BDNF的抑制凋亡效应与L-NAME无关,仅受Ly294002影响;在体内,经L-NAME喂养的小鼠皮下Matrigel栓中的新生血管数量与未经L-NAME喂养的小鼠相比显著减少。结论BDNF通过AKT/eNOS信号通路活化介导血管新生,这可能成为治疗多发性骨髓瘤血管新生的新靶点。第四部分表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立目的过去的研究证实BDNF在体外具有促进MM细胞增殖并诱导MM血管新生的能力。为了进一步探索BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点,我们建立人MM荷瘤小鼠模型,并比较两种模型的优缺点,为深入探索治疗MM的新靶点奠定基础。方法选择糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,通过皮下注射或尾静脉注射人骨髓瘤细胞株RPMI8226建立两种异体移植动物模型。荷瘤后观察小鼠的生长状态、测量皮下瘤块的体积;荷瘤后3周,每周经眼眶后静脉丛采血,检测血清中人源LAM轻链含量、Ca2+浓度和血浆中人源BDNF浓度,并计数红细胞;小鼠死后,采用组织学方法观察瘤细胞的形态特征,流式细胞术检测小鼠外周血和骨髓中人源性CD38+细胞比例,计算机X线数字摄影观察小鼠全身骨密度的改变和骨质破坏情况。结果皮下注射模型的成瘤率高(5/5),具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征,但其骨髓中未检测到MM细胞、血清中钙离子浓度不高、M蛋白浓度升高不明显且未发现溶骨性损害的组织学和影像学证据。尾静脉注射模型成瘤率相对较低(4/7),骨髓中可检测到呈浸润生长的人CD38+细胞;而且在荷瘤3周后,血清中即可检测到人源M蛋白;随着肿瘤的生长,M蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高,并有溶骨性损害的影像学证据。两种模型血浆中人源BDNF的水平亦逐渐升高,9周时浓度分别为(73±11)pg/ml和(105±18)pg/ml。结论本研究成功建立了两种高表达BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型,两种模型相互结合应用,为探索MM治疗的新靶点BDNF/TrkB提供了合适的动物模型。