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乳腺癌是女性中常见的癌症,是造成妇女死亡率最高的癌症。DNA甲基化可以通过调节基因的表达影响细胞免疫、胚胎发育及肿瘤发生。研究发现,死亡相关蛋白激酶(DAPK)参与细胞凋亡、迁移、自噬等生物学功能。DAPK启动子区域甲基化可使其表达沉默,与肿瘤的发生和转移密切相关。本研究试图评估DAPK在乳腺癌中的mRNA表达以及DAPK启动子甲基化情况,为未来乳腺癌的早期诊断及药物治疗提供方向。本研究分别在3种乳腺细胞系(MCF10A,正常乳腺细胞系;MCF7, ER阳性乳腺癌细胞系;MDA-MB-231,三阴性乳腺癌细胞系)和32位病人的新鲜癌组织与相应癌旁组织中利用Real-time PCR检测DAPK的表达。结果显示,DAPK的mRNA在MCF10A中相对于MCF7和MDA-MB-231表达较高。在乳腺癌患者中,不管是在癌组织还是相应的癌旁组织中,DAPK均有表达,但在18位病人癌组织中DAPK表达较低,约占56%。进一步结合DAPK的mRNA表达与临床病理数据分析,发现DAPK的表达与HER2表达呈负相关(P<0.01)。同时,通过MSP检测DAPK启动子甲基化,发现在细胞系MCF10A、MDA-MB-231中DAPK均未受到甲基化作用,而在MCF7中DAPK基因部分被甲基化,部分未被甲基化。在病人的癌组织中,DAPK甲基化约占62.5%,癌旁组织中占75%；癌组织中未被甲基化大概占93.6%,癌旁组织中未被甲基化的样本约占87.5%。设计合成检测位点甲基化和非甲基化序列并克隆到特定的质粒中作为标准品,运用qMSP进一步绝对定量检测样本中DAPK启动子甲基化,结果显示,在癌组织中DAPK启动子甲基化普遍偏高,且相对癌旁组织高出近2-10倍。在乳腺细胞系及病人样本中针对DAPK启动子设计的特异性甲基化检测引物,其检测区域为(-1197--1092),共计106bp,包含CpG岛上六个具体的甲基化位点。据在线软件推测分析,在DAPK翻译起始位点上游近2400bp中,共含有2个可能的CpG岛,故本实验共克隆了DAPK翻译起始位点上游2570bp的序列长度,将其克隆到去除CMV启动子的pEGFP-N1质粒中,该质粒命名为pDp-EGFP。pDp-EGFP质粒的功能在HeLa细胞得到成功验证。pDp-EGFP质粒的构建将为进一步探索DAPK启动子中其他具体甲基化位点及其转录调控的分子机制奠定了基础。