背景与目的肾小管上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)在肾间质纤维化的发生、发展中起重要作用。转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1被认为是诱导EMT的主要因子之一。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是调节血管发生的基本生长因子。近来许多研究发现VEGF在许多肾脏病中包括肾纤维化中发挥了保护作用。本部分的研究目的是探讨VEGF对TGF-β1诱导的EMT的作用。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)分为：(1)正常对照组；(2)TGF-β1(5μg/L)阳性对照组；(3)TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(0.1、1、10、100μg/L)共同作用组；体外作用48h,免疫组化双染、激光扫描共聚焦方法检测各组HK-2细胞αc-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达情况,RT-PCR法、Western Blot法检测各组细胞α-SMA、 E-cadherin、波形蛋白(Vimentin)的mRNA及蛋白水平。ELISA测定培养液上清中纤维连接蛋白(fibronectin, FN)和I型胶原(collagen Ⅰ, COLⅠ)的表达情况。结果免疫组化双染、激光扫描共聚焦结果显示TGF-β1阳性对照组与正常对照组相比较,α-SMA表达水平显著增强,而E-cadherin表达显著减弱；TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA表达与阳性对照组相比明显减弱,而E-cadherin表达明显增强,且呈VEGF165剂量依赖的关系。Western blot、RT-PCR和ELISA结果显不TGF-β1作用组细胞α-SMA、Vimentin表达及培养液上清中FN、COLⅠ比正常对照组明显增强,而E-cadherin表达明显减弱；TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA、Vimentin表达及培养液上清中FN、COLⅠ比TGF-β1阳性对照组明显减弱,而E-cadherin表达增强,且呈VEGF165剂量依赖的关系。TGF-β1+VEGF165(10、100μg/L)共同作用组与TGF-β1阳性对照组相比,α-SMA、Vimentin表达及培养液上清中FN、COLⅠ水平显著降低,而E-cadherin表达则显著增强(P<0.05)。结论TGF-β1能诱导体外培养的HK2细胞发生EMT, VEGF165能以浓度依赖方式抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT。背景与目的TGF-β1主要通过Smad和非Smad信号(包括Erk1/2等)转导途径参与调节肾小管上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT);在TGF-β1信号通路中,SnoN作为辅助调节因子,抑制Smad蛋白介导的转录活性,从而负性调节基因的表达。本部分的研究目的是探讨VEGF抑制‘TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT的过程中对Smad2/3, Smad7, Erk1/2信号途径以及SnoN表达的影响。方法体外培养的HK-2细胞分为：(1)正常对照组；(2) TGF-β1(5μg/L)阳性对照组：(3)VEGF165(100μg/L)作用组；(4)TGF-β1+VEGF165共同作用组：TGF-β1(5μg/L)与VEGF165(100μng/L)共同作用,Western Blot法和RT-PCR分别检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3、p-Erkl/2和Erkl/2(共同作用30和60min)、α-SMA、Smad7、SnoN表达水平(共同作用48h)。结果1Western Blot显示TGF-β1组a-SMA蛋白表达与正常对照组比较明显增强,TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA蛋白表达与阳性对照组比较明显减弱(p<0.05);2HK2细胞体外刺激30min,60min, TGF-β1组与正常对照组比较,(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及(p-Erkl/2)/(Erkl/2)比值明显升高,TGF-β1+VEGF165组与阳性对照组相比二者均明显下降,且均以30min下降明显；3体外刺激48h,TGF-β1组与正常对照组相比较,Smad7蛋白和nRNA明显下降,VEGF165+TGF-β1组较阳性对照组Smad71(?)显升高(p<0.05)；4VEGF)65单独处理组与正常对照组相比,(p-Erk1/2)/(Erkl/2)比值明显升高(p<0.05), a-SMA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、Smad7蛋白和mRNA表达均无明显差异(p>0.05)；5TGF-β1组SnoN蛋白表达与正常对照组比较明显增强(p<0.05), TGF-β1与VEGF165共同作用组SnoN蛋白表达与阳性对照组相比无明显差异(p>0.05),各组SnoNmRNA表达均无明显差异(p>0.05)结论VEGF165抑制’TGF-β1诱导HK-2细胞EMT的机制可能与直接抑制Smad2/3磷酸化、上调Smad7信号表达,以及间接抑制Erk1/2信号磷酸化有关；而与SnoN表达无关。背景与目的VEGF与其受体结合后可激活多种信号转导途径。其中PI3K/Akt信号转导途径是VEGF发挥各种生理病理作用的重要通路。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)一方面作为TGF-β1的下游介质介导细胞增殖和细胞外基质(包括FN, COLI等)的产生,另一方面CTGF也可直接诱导肾小管上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的发生。本部分的研究目的是探讨VEGF是否通过PI3K/Akt信号途径参与抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT的作用；以及VEGF是否通过该信号途径发挥对Smad信号途径以及CTGF和细胞外基质表达的影响。方法体外培养的HK-2细胞分组为：(1)正常对照组、(2)TGFβ1(5μg/L)阳性对照组、(3)VEGF165(100μg/L)、(4) TGFβ1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)组、(5)LY294002作用组(25μmol/L)、(6)TGFβ1(5μg/L)+LY294002(25μmol/L)、(7)VEGF165(100μg/L)+LY294002(25μmol/L)、(8)TGFβ1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)+LY294002(25μmol/L)组。激光扫描共聚焦方法检测各组HK-2细胞的α-SMA、E-cadherin表达, Western Blot法和RT-PCR检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3(共同作用30min)、Smad7、α-SMA、CTGF表达水平(共同作用48h)。 ELISA检测各组细胞的培养液上清中FN和COL I的表达。结果TGF-β1作用组α-SMA与CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及细胞的培养液上清中FN、COL I表达与正常对照组相比较明显增强,而E-cadherin、Smad7表达明显减弱；TGFβ1与VEGF165共同作用组α-SMA与CTGF蛋白和1nRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及培养液上清中FN.COLI表达比TGFβ1阳性对照组明显减弱,而E-cadherin、Smad7表达明显增强。TGFβ1+LY294002共同作用组a-SMA与CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及培养上清中FN、COLI表达比TGF-β1作用组轻度下降,E-cadherin Smad7表达轻度升高,但差异均无统计学意义。TGFβ1+VEGF165组中加入LY294002后,a-SMA与CTGF蛋白和mRNA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)及培养上清中FN、COLI表达均明显增强,E-cadherin、Smad7表达减弱,与TGF-β1作用组相比差异无明显统计学意义。结论VEGF165抑制TGF-β1诱导HK-2细胞发生的EMT,其机制可能与VEGF通过PI3K信号转导通路抑制Smad信号活化、下调HK-2细胞CTGF表达及减少细胞外COLI合成有关。背景与目的骨形成蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7, BMP-7)能维持肾小管上皮细胞形态、功能并逆转肾小管上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。 BMP-7主要通过激活Smad1/5/8信号转导途径发挥作用。本部分的研究目的是探讨VEGF抑制EMT的作用与BMP-7及其信号转导途径表达变化的关系。方法将体外培养的HK-2细胞分为正常对照组、阳性对照组(TGF-β1,5μg/L)、TGF-β1(5μg/L)+VEGF,65(0.1-101μg/L)共同作用组,HK-2体外培养30min、60min、24h、48h,用Western Blot方法检测不同组BMP-7以及p-Smadl/5/8、Smad1/5/8表达变化(以磷酸化与非磷酸化比值表示信号的磷酸化水平)；选取VEGF165对Smadl/5/8信号磷酸化作用最大的时间点用Western Blot方法检测其剂量依赖的关系。结果TGF-β1组BMP-7蛋白表达与正常对照组相比较明显减弱；TGF-β1与VEGF165共同作用组BMP-7蛋白表达与阳性对照组相比有增强趋势,且表现为VEGF165剂量依赖性。HK-2体外培养不同时间,TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)组(p-Smad1/5/8)/(Smad1/5/8)在30min时达最高峰,随时间延长呈下降趋势。HK-2细胞体外培养30min, TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(0.1-100μg/L)组(p-Smad1/5/8)/(Smad1/5/8)呈上升趋势,表现为VEGF165剂量依赖性。单独TGF-β1处理几乎不能激活Smad1/5/8的磷酸化。结论VEGF165抑制’TGF-β1诱导的体外培养的HK-2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF上调BMP-7后激活Smad1/5/8信号有关。背景与目的分化抑制因子(inhibitor of DNA binding/differentiation, Id)是一组能够对碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子活性起负调节作用的转录因子。哺乳类动物细胞含Id1-Id4共4种Id因子,该分子参与细胞分化、细胞衰老、神经形成、凋亡及血管生成等过程。我们既往的研究显示VEGF165抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)机制可能与VEGF165上调Id2的表达有关,而与Id3表达无关。本部分的研究目的是进一步明确VEGF165是否通过Id2抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞发生EMT。方法将体外培养的HK-2细胞分为非沉默siRNA与Id2沉默siRNA,然后分别给予TGF-β1(5μg/L)、VEGF165(100μg/L)、TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)刺激及不加刺激,HK-2细胞体外培养48h,分别用Western Blot和RT-PCR方法检测不同组Id2、α-SMA以及E-cadherin的蛋白和mRNA的表达。结果非沉默siRNA处理后,TGF-α1诱导的Id2蛋白表达与不加刺激组相比明显减弱；TGF-β1与VEGF165共同刺激组Id2蛋白表达与单用TGF-β1刺激相比明显增强(P<0.05)。与非沉默siRNA处理的细胞相比,Id2沉默siRNA处理后,同样给予TGF-β1刺激,TGF-β1诱导的α-SMA的蛋白和mRNA表达进一步增加,E-cadherin的蛋白和-nRNA表达进一步减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。同样给予TGF-β1与VEGF165共同刺激,Id2沉默siRNA处理与非沉默siRNA处理的细胞相比,a-SMA的蛋白和1nRNA表达明显增加,E-cadherin的蛋白和mRNA表达明显减少。结论VEGF165通过Id2抑制了TGF-β1诱导的体外培养的HK-2细胞发生EMT。背景与目的肾小管上皮-间充质细胞转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)是肾间质纤维化的主要细胞机制之一。TGF-β1、CTGF是主要的致纤维化因子,在EMT的发生和发展过程中的起重要作用。而BMP-7是维持肾小管上皮细胞功能的重要因子之一并能逆转EMT,体内实验显示BMP-7能减轻大鼠肾间质纤维化。我们以前体外的研究结果显示,VEGF能抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞发生EMT,其机制可能与VEGF下调CTGF,上调BMP-7有关。本研究目的在于探讨VEGF对UUO小鼠的肾间质纤维化及EMT的作用及其和TGF-β1、CTGF及BMP-7表达变化的关系。方法雄性CD-1小鼠36只,体重21—24g,分为3组：1、假手术组(n=12)；2、UUO模型组(n=12);3、UUO+VEGF处理组(n=12):VEGF12150μg· kg-1,2/d,皮下注射。分别于第3、7、14天处死动物,留取梗阻侧的肾脏组织。行HE和Masson染色评估肾间质纤维化程度；免疫组化法检测肾脏组织a-SMA表达情况：Western Blot、RT-PCR方法检测肾脏组织a-SMA、E-cadherin、TGF-β1、CTGF及BMP-7蛋白和mRNA水平的表达情况。结果在同一时间点与假手术组相比较,UUO模型组第3、7、14d肾间质纤维化程度明显加重(P<0.05),随梗阻时间延长,UUO模型组肾间质纤维化程度不断加重(P<0.05)；在第3、7d,VEGF处理组较UUO模型组肾间质纤维化程度明显减轻(P<0.05)。与假手术组相比较,UUO模型组在第3、7、14d的α-SMA、TGF-p1和CTGF的蛋白及mRNA表达水平明显增强,E-cadherin、BMP-7表达明显减弱(P<0.05),随着梗阻时间的延长,UUO模型组a-SMA、TGF-β1和CTGF的表达水平不断增强,E-cadherin、BMP-7表达不断减弱(P<0.05)；在第3、7d, VEGF处理组较UUO模型组a-SMA、TGF-p1和CTGF的表达水平明显减轻, E-cadherin、BMP-7表达明显增强(P<0.05)。在第14d,VEGF处理组仅CTGF的表达仍明显减轻(P<0.05)。结论在UUO慢性纤维化小鼠模型中,外源性VEGF具有减轻肾间质纤维化与EMT的作用,此作用可能与VEGF下调肾脏组织TGF-β1、CTGF表达及上调BMP一7表达有关,其确切机制有待进一步探讨。