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当归是当今临床应用最为广泛的活血化瘀药之一,素有“十方九归”之说。多糖在当归中的含量较高,约为10%～15%。当归传统上常用酒炙法炮制,经过酒炙后通经活络散瘀之功增强,酒炙后当归是否因为多糖成分的改变而导致药效的改变未见报道。本实验拟通过研究酒炙前后当归多糖对急性血瘀证大鼠的药效作用差异,探索阐释其发挥治疗作用的潜在机制,初步奠定当归多糖的炮制转化理论的研究基础,以期为阐明当归多糖组分的药效作用及为临床血瘀证的用药选择提供实验依据。实验方法:1.按照《中国药典》(2015年版)第四部炮制通则,在生当归饮片中按一定比例加入黄酒闷透,置锅中炒至两面金黄色,制成酒当归饮片。生当归饮片和酒当归饮片分别经热水回流提取、醇沉、sevage法除去蛋白、蒸馏水透析后制得精制生当归总多糖和酒当归总多糖,以标准葡萄糖为对照品,应用苯酚硫酸比色法测出生当归总多糖和酒当归总多糖中相当于葡萄糖含量的总多糖含量,采用硫酸-咔唑法检测生当归总多糖和酒当归总多糖中糖醛酸的含量。2.以皮下注射肾上腺素联合冰水浴法共同复制大鼠急性寒凝气滞血瘀证模型,经口服分别灌胃给药低剂量(400 mg/kg)、高剂量(800mg/kg)的生当归多糖和酒当归多糖水溶液,对血瘀证大鼠进行干预治疗。通过血流变检测仪测定酒炙前后当归多糖对急性血瘀证大鼠血流变学指标的影响,通过全自动凝血仪测定各组大鼠血浆中凝血四项功能指标的影响,苏木精-伊红HE染色法观察大鼠心脏和肺组织病理状态的变化,计算各组大鼠免疫器官胸腺指数和脾脏指数的变化,同时检测各组大鼠血浆中氧化应激指标总超氧化物歧化酶T-SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px和丙二醛MDA含量的变化。3.通过建立过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC的氧化性损伤为体外实验模型,cck-8检测酒炙前后当归多糖对过氧化氢诱导损伤的HUVEC的增殖活性的影响,检测各组细胞上清液中一氧化氮NO和乳酸脱氢酶LDH的含量变化,从细胞水平研究酒炙前后当归多糖对HUVEC损伤的抗氧化保护作用。实验结果:1.生品当归饮片为浅黄色,质柔韧,酒当归饮片为深黄棕色,略有焦斑,质硬脆;生当归多糖为黄白色粉末,酒炙后当归多糖为深黄色粉末;生当归总多糖提取得率为13.9%,酒当归总多糖提取得率为15.6%,其中生当归总多糖中多糖含量83.1%,酒当归总多糖中多糖含量86.5%;生当归总多糖中糖醛酸含量40.2%,酒当归总多糖中糖醛酸含量43.6%。2.与模型组比较,生当归多糖组和酒当归多糖组均能降低血瘀证大鼠的全血黏度(WBV)和血浆黏度(PV),降低血浆中纤维蛋白原FIB含量,延长大鼠血浆的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)(P<0.05,P<0.01);与阳性药复方丹参滴丸组的结果的比较,生当归多糖高剂量组改善大鼠血液流变性和凝血系统功能的效果与之接近,差异无统计学意义(P>0.05),酒当归多糖低、高剂量组效果优于复方丹参滴丸组(P<0.05);生当归多糖及酒当归多糖均能改善血瘀证模型组大鼠心肌细胞加宽、心肌细胞核变圆、肺泡壁增厚、肺间质水肿和肺出血等现象,其中酒当归多糖药效优于生当归多糖。3.模型组大鼠胸腺指数和脾脏指数显著升高(P<0.01),给药后,生当归多糖对血瘀证大鼠胸腺指数和脾脏指数的作用无统计学意义(P>0.05),酒当归多糖显著降低大鼠胸腺指数和脾脏指数(P<0.05)。4.模型组大鼠血浆中丙二醛MDA含量显著升高,超氧化物歧化酶T-SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性显著下降(P<0.01);与模型组比较,生当归多糖组和酒当归多糖组MDA含量降低,T-SOD和GSH-Px活性显著增高(P<0.05,P<0.01);与复方丹参滴丸组的结果的比较,生当归多糖组改善大鼠氧化应激水平的效果与复方丹参滴丸组接近,差异无统计学意义,酒当归多糖低剂量组增强GSH-Px活性的效果优于复方丹参滴丸组(P<0.05),酒当归多糖高剂量组增强T-SOD和GSH-Px活性的效果优于复方丹参滴丸组(P<0.05)。5.生当归多糖对过氧化氢损伤的HUVEC的增殖活性无显著作用(P>0.05),酒当归多糖显著增强损伤HUVEC的增殖活性(P<0.05)。生当归多糖对过氧化氢损伤的HUVEC内的NO活性的作用无显著性差异(P>0.05),酒当归多糖能显著增强HUVEC释放的NO含量(P<0.05)。生当归多糖和酒当归多糖均能有效降低过氧化氢损伤的HUVEC细胞的LDH漏出量(P<0.05,P<0.01)。实验结论:当归酒炙后多糖成分更易于溶出,酒当归总多糖中的多糖含量增多。酒当归多糖改善急性血瘀大鼠血流变性、凝血系统功能和组织病理形态的效果优于生当归多糖,其机制可能与酒炙后多糖组分含量的改变、大鼠氧化应激水平、机体免疫功能、血管内皮细胞损伤的改善有关。同时也证明了多糖组分应为当归活血祛瘀作用的物质基础,而酒炙炮制可增强其活血祛瘀的作用,多糖转化、活性增强,应为当归酒炙炮制的内涵机制之一。