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原发性肾病综合征是儿童时期最常见的肾脏疾病之一,在治疗上主要是免疫抑制治疗,糖皮质激素或免疫抑制剂长期应用给患儿的生长发育、心理健康造成了不可忽视的副作用,给患儿及家庭带来了极大的经济压力和心理负担。肾病综合征发病机制未明,一直是儿肾科医生关注的重点,足细胞功能受损是蛋白尿发生关键环节,但机制并未完全阐明。既往研究发现的众多靶点,如nephrin、podocin等足细胞相关蛋白表达的异常,不能完全解释儿童肾病的机理,因此以足细胞为靶点,积极寻找原发性肾病综合征诊断、治疗的新靶标,并深入探讨其作用机制显得尤为必要。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA分子,与靶基因mRNA的3’非编码区配对结合,调节相关基因的表达,广泛调节机体的各项生命活动。miR-30a-5p是本研究小组前期通过低密度芯片筛选出,在肾病综合征患者血浆及尿液中差异表达的miRNA。进一步文献检索发现,与肾脏其它类型细胞相比,miR-30s家族无论是在小鼠体内还是体外培养的足细胞中都广泛而稳定的表达,并参与调节足细胞生理病理过程,该家族成员对维持足细胞稳态方面具有重要作用。那么在儿童原发性肾病综合征中高表达的miR-30a-5p,究竟扮演了什么样的角色呢?本研究旨在观察miR-30a-5p对足细胞生物学特征(如增殖、迁移)的影响,并探索miR-30a-5p对足细胞相关蛋白表达的影响,为原发性肾病综合征足细胞损伤的防治提供新的线索及潜在的干预靶点。研究目的:1.通过肾病大鼠模型验证miR-30a-5p在肾组织的表达。2.观察miR-30a-5p对足细胞增殖、迁移、周期、凋亡的影响。探讨miR-30a-5p对足细胞功能的影响。3.观察miR-30a-5p对足细胞足突相关蛋白表达的影响,探讨miR-30a-5p对足细胞影响的机制。研究方法:1.通过SD大鼠鼠尾注射嘌呤霉素,构建肾病大鼠模型,检测肾病大鼠肾组织miR-30a-5p的表达量。电镜下观察肾足细胞形态。miR-30a-5p过表达,沉默和空载对照慢病毒分别转染足细胞系,获得miR-30a-5p过表达,沉默足细胞系,Realtime PCR验证稳定过表达株、沉默株建立成功。体外培养稳定转染miR-30a-5p过表达和沉默的人足细胞系,以转染空载病毒为对照。CCK8法检测足细胞的增殖情况,用transwell法检测足细胞迁移能力,PI染色DNA的方法检测足细胞周期,Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒检测足细胞凋亡。2.体外培养稳定转染miR-30a-5p过表达、沉默的足细胞系,以转染空载病毒为对照。诱导细胞分化成熟后,采用Realtime PCR、Western Blot技术,检测足细胞 CD2AP、nephrin、podocin、F-actin、synaptopodin 蛋白的表达水平。研究结果:1.肾病大鼠的肾组织中miR-30a-5p表达量明显增加,尿蛋白增加,足细胞足突出现融合现象。体外培养的足细胞过表达miR-30a-5p之后抑制了细胞增殖,促进足细胞迁移,对周期和凋亡没有明显影响。2.过表达 miR-30a-5p 之后足细胞中 CD2AP、podocin、synaptopodin 在 mRNA和蛋白水平的表达量都明显增加,nephrin在蛋白水平表达显著增加,F-actin与对照组相比表达没有差异;沉默miR-30a-5p之后,CD2AP蛋白表达量下降。过表达miR-30a-5p同时沉默CD2AP之后,足细胞SD蛋白复合体蛋白表达下降。研究结论:1.肾病大鼠肾组织中miR-30a-5p表达增加,促进蛋白尿的发生和足突融合。体外培养足细胞过表达miR-30a-5p后能够抑制细胞增殖,促进足细胞迁移能力,对细胞周期及凋亡没有明显影响;沉默miR-30a-5p对足细胞功能无明显影响。2.miR-30a-5p在足细胞通过作用CD2AP,影响足细胞相关蛋白的表达。