乳链菌肽(nisin)又称乳酸链球菌素,是乳酸乳球菌乳酸亚种某些菌株产生的抗菌肽。Nisin对革兰氏阳性菌具有抗菌作用,可抑制一些能够引起食品腐败的细菌和芽孢,因此可用于肉类、酒类、乳类等的防腐。由于乳酸链球菌素是纯天然防腐剂,采用乳酸菌发酵法产生,进入人体即被酶分解为多种氨基酸,无残留,不产生抗药性,不影响人体益生菌,具有广阔的市场效益和经济价值。但是其生产水平较低,成本偏高导致nisin价格始终高于市售的其它防腐剂,这将阻碍nisin的推广。近年来由于分子生物学及其相关技术的发展,国内外学者逐渐开始将目光投向生物技术领域,尝试通过基因工程的方法手段来提高nisin的产量。乳酸乳球菌本身也是一种革兰氏阳性菌,但因其具有对nisin产生免疫的抗性基因nis I,nisFEG的存在,使乳酸乳球菌可防御nisin对自身的毒害作用。前体基因nisA负责合成前乳链菌肽,经过加工修饰,再切除前导肽便形成成熟的乳链菌肽分子。本论文结合文献及Genbank中所报道的nisA与nisI基因序列来设计引物,以乳酸乳球菌的基因组为模板通过PCR技术手段获取nisA基因与nisI基因。然后将nisA基因与T载体连接,对连接成功的含有目的片段的T载体进行双酶切以暴露目的基因的粘性末端,同时对质粒pMG36e采用相同的限制性内切酶双酶切以暴露与目的基因互补的粘性末端。将目的基因与酶切后的载体进行连接,即可获得含有目的基因的环状质粒p MG36e-nisA。pMG36e-nisA-nisI采用相同的方法在p MG36e-nisA的基础上构建完成,最后再将构建好的质粒导入到乳酸乳球菌中。以nisin的产量为指标,对转化子进行筛选,找到一株nisin高产基因工程菌AI-5。并通过对其生长曲线、nisin抗性能力和遗传稳定性的测定,我们掌握了AI-5的生长规律,AI-5被确认为一株产nisin的稳定高产基因工程菌。在摇瓶培养条件下,通过单因素实验、正交等实验设计方法进行发酵培养基和培养条件的优化。最佳发酵条件为:30℃静置发酵16 h,发酵6 h的时候用5M的NaOH将发酵液p H调节至6.5,随后每2 h调节一次pH至6.5,直到发酵结束。最佳发酵培养基的主要配方为:蔗糖30g/L、蛋白胨25g/L、酵母粉7g/L、牛肉膏7g/L、Na2HPO4·12H2O 20g/L、MgSO4 0.3g/L、维生素C 0.5g/L。优化后基因工程菌的nisin产量达到2891 IU/mL,是优化前的4倍,对比相同培养条件下的野生型菌株产量提高了20.07%。