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研究背景染色体平衡易位是染色体结构重排的一种,发生率约为1/625,其携带者通常没有明显的表型异常,但与反复流产、死胎、死产、新生儿精神发育迟缓及其他先天畸形等不良妊娠结局密切相关。导致反复流产的染色体平衡易位最多见的是染色体相互易位及罗伯逊易位。理论上染色体相互易位携带者减数分裂形成正常配子的概率为1：18,罗伯逊易位携带者形成正常配子的概率为1：6,所以通常建议所有的染色体平衡易位携带者做产前诊断。准备用辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)进行助孕治疗的夫妻,若一方存在染色体平衡易位,则建议其行胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)。可以通过免疫荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction, PCR)、阵列-比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH)、单核苷酸多态性分析(single nucleotide polymorphism, SNP)对染色体平衡易位携带者的胚胎进行PGD,目前大多数国内生殖中心多采用aCGH及SNP array技术。以二代测序技术(next generation sequencing, NGS)为基础的拷贝数变异测序(copy number variation sequencing, CNV-Seq)以其高通量、高灵敏度、低成本在PGD以及植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening, PGS)中逐渐体现出其优势,不仅可以筛查胚胎的整倍体性,还可以检测出基因拷贝数变异(copy number variations, CNVs)。鉴别染色体平衡易位携带者胚胎是正常胚胎还是染色体平衡易位胚胎,是染色体平衡易位携带者PGD的难点,目前的普遍做法是移植整倍体胚胎,不进行进一步鉴别,若将染色体平衡易位胚胎进行移植,其出生后仍存在和亲代同样的生育问题。因此,本实验通过CNV-Seq技术对染色体平衡易位携带者进行PGD,验证其效能的同时,采用mate pair文库测序联合PCR方法对正常胚胎以及平衡易位胚胎进行鉴别,为染色体平衡易位携带者PGD提供新的有效方法。研究目的1.证实以NGS为基础的CNV-Seq技术在染色体平衡易位携带者PGD中的有效性;2.建立并优化通过mate pair文库测序区分染色体相互易位胚胎和正常胚胎的操作流程；3.验证mate pair文库测序联合PCR鉴别染色体相互易位胚胎和正常胚胎的准确性;4.通过筛选后移植正常胚胎提高染色体相互易位携带者妊娠率。研究方法1.将纳入病例女方予控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH),卵泡达到取卵要求时阴道B超监测下取卵,取卵日男方采集精液,经处理后行卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI),形成受精卵培养,对卵裂球或囊胚期滋养层细胞进行活检;2.胚胎细胞活检,行全基因组扩增(whole genome amplification, WGA),测序,筛选出拷贝数正常胚胎;3.患者选择整倍体胚胎进行移植,计算种植率、持续妊娠率及活产率;4.将纳入mate pair文库测序研究的夫妻染色体平衡易位的一方取静脉血提取DNA,测序并建立mate pair文库,寻找断裂点;5.根据断裂点设计并测试引物,通过PCR的方法用引物检测已筛选出的正常或染色体平衡易位胚胎基因组是否存在断裂点,若存在即证明其为染色体平衡易位胚胎,否则为正常胚胎;6.将筛检后胚胎进行植入,妊娠后18-20周取羊水,行羊水细胞染色体核型分析;7.将PCR检测结果与胎儿染色体核型进行比对,判断mate pair文库测序的诊断效能。结果1.21对夫妻可供活检的胚胎共113枚,其中98枚(86.7%)进行了CNV-Seq;成功筛查了胚胎的整倍体性,甚至发现了0.8Mb的微小拷贝数变化,并且发现了嵌合比例为20%的嵌合体;2.8对夫妻(38.1%)所有的胚胎均异常,无整倍体胚胎可移植,13对夫妻至少有一枚整倍体胚胎可供移植;均进行了解冻移植,种植率为78.6%,持续妊娠率为70%,活产率60%;3.成功优化mate pair文库测序与PCR技术相结合的方法区分染色体相互易位胚胎和正常胚胎的操作流程,分别将2枚鉴别为完全正常的胚胎及2枚染色体平衡易位胚胎进行移植,成功妊娠;4.经羊水穿刺对胎儿进行染色体核型分析,核型结果与PCR测试结果一致,证明mate pair文库技术联合PCR鉴别正常胚胎诊断准确。结论1.以NGS为基础的CNV-Seq技术可用于染色体平衡易位携带者PGD,灵敏高效,取得较高的临床种植率,持续妊娠率及活产率;2.进一步证实染色体平衡易位携带者的胚胎具有较高的非整倍体胚胎比率;3. CNV-Seq技术分辨率较高,除可检测微缺失及微重复外,还可以发现嵌合体;4.将CNV-Seq技术、mate pair文库测序技术与PCR技术相结合,可用于鉴别正常胚胎及染色体平衡易位胚胎。