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目的:(1)探究慢性铝暴露经PHF8-H3K9me2-BDNF通路对大鼠海马长时程增强(LTP)的影响;(2)探讨染铝对人源性神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中P HF8-H3K9me2-BDNF通路的影响。方法:1.动物体内实验研究:1)160只雄性SD大鼠,分别染毒3、6、9、12个月,共计四批,每一批大鼠40只,并按体重随机分为对照和72、12、2mg/kg 4个剂量组,每日经饮水途径建立铝染毒模型;2)电生理学方法检测大鼠在体海马LTP;3)ELISA法检测大鼠海马PHF8酶活性;RT-PCR法测定PHF8的mRNA的表达;4)Western-blot法测定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表达量。2.体外实验研究:1)培养SH-SY5Y细胞并用三氯化铝进行染毒,实验分组为分别为空白对照,1mMAl3+,2mMAl3+,4mMAl3+4个剂量组,染毒48小时后测定各项指标;2)CCK-8法测定细胞活力;ELISA法检测细胞PHF8酶活性;RT-PCR法测定PHF8的mRNA的表达;3)Western-blot方法测定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表达量。结果:1、体内实验(1)电生理学方法检测大鼠在体海马LTP:染毒时间与剂量间存在交互效应(P<0.01)。各批次内不同剂量大鼠海马标化的fEPSP振幅差异有统计学意义(P<0.05),且随着染毒剂量的增大,标化的fEPSP振幅呈逐渐下降趋势。对照、低、中剂量组内不同批次标化fEPSP幅度差异有统计学意义(均P<0.01),而高剂量组内不同次标化批次fEPSP幅度差异无统计学意义(p>0.05)。(2)elisa法测定大鼠海马h3k9去甲基化酶活性:染毒时间和剂量间无交互作用(p>0.05),不同剂量组大鼠海马h3k9去甲基化酶酶活性差异有统计学意义(p<0.01),且与对照组相比,中、高剂量酶活性分别降低了24.07%和33.62%,差异有统计学意义(p<0.05)。在不同批次间比较,发现随着染毒时间的延长,大鼠海马h3k9去甲基化酶酶活性呈逐渐下降趋势,各批次间酶活性比较差异有统计学意义(p<0.01),其中,与染毒3个月相比,9、12个月大鼠海马h3k9去甲基化酶酶活性分别降低了15.77%,15.23%。(3)rt-pcr法测定phf8的基因表达情况:四个批次大鼠海马内phf8基因表达,染毒时间与剂量间无交互效应(f=0.833,p>0.05)。phf8基因在各剂量组间和各批次间的表达差异均无统计学意义(p>0.05)。(4)western-blot方法测定phf8、h3k9me2、bdnf的蛋白表达情况:1)phf8表达量的改变:染毒时间和剂量间存在交互效应(p<0.05)。在四个批次内,各剂量组间phf8表达量差异有统计学意义(均p<0.01),且各批次内高剂量组phf8蛋白表达量与对照组比分别下降了22.90%,28.02%,24.22%,27.14%。进一步分析同一剂量不同批次间蛋白表达量改变,发现只有在高剂量组内,随着染毒时间的延长,phf8表达量逐渐下降,且不同批次间大鼠海马phf8表达量差异有统计学意义(p<0.05);2)h3k9me2,bdnf表达量的改变:染毒时间和剂量间不存在交互效应(p>0.05)。分别分析染毒剂量和时间对大鼠海马h3k9me2、bdnf表达量的影响:各剂量组蛋白表达差异有统计学意义(均p<0.01),且随着染毒剂量的增加,h3k9me2表达量增加而bdnf表达量下降。其中,中、高剂量组h3k9me2表达量与对照组相比分别增加了13.00%,27.55%;与低剂量组比分别增加了12.12%,26.26%。,差异均有统计学意义(p<0.05);而与对照组比,中、高剂量组大鼠海马bdnf表达量分别降低了20.88%和30.10%,差异有统计学意义(p<0.01);与低剂量组比,中、高剂量组大鼠海马bdnf表达量分别降低了8.86%和17.70%,差异有统计学意义(p<0.05)。各批次间h3k9me2、bdnf表达量差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01),且随着染毒时间的增加h3k9me2表达量增加而bdnf表达量降低。其中12个月h3k9me2表达量与3、6个月相比均增加了10.34%,差异有统计学意义(p<0.05)。而9、12个月的bdnf的表达量与3个月相比,下降了9.75%,14.63%,差异均有统计学意义(p<0.05)2.体外实验:(1)CCK-8细胞活力测试:各染毒组细胞活力差异有统计学意义(F=44.42,P<0.01),与对照组比,2、4mM Al3+染毒组细胞活力分别下降了23%和32%,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)ELISA法测定细胞核内PHF8活性:各剂量组细胞H3K9去甲基化酶活性比较差异有统计学意义(P<0.05),酶活性随着染毒剂量的增加而下降。高剂量组酶活性下降最为明显,与对照、低、中剂量组相比分别下降了24.87%,24.47%、16.06%,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)RT-PCR法测定PHF8基因表达量:各剂量组细胞PHF8基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。(4)Western-blot法测定PHF8、H3K9me2、BDNF的蛋白表达情况:各剂量组PHF8、H3K9me2、BDNF蛋白表达量差异有统计学意义(均P<0.05)。且随着染毒剂量的增加,PHF8和BDNF表达量呈下降趋势,而H3K9me2表达量呈上升趋势。与对照组相比,中、高剂量组PHF8表达量分别降低了11.20%,21.10%,差异有统计学意义(P<0.05),与低剂量组比,高剂量组PHF8表达量降低了20.45%,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照、低剂量组相比,高剂量组H3K9me2表达量分别增加了20.59%,14.71%,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照、低剂量组相比,高剂量组BDNF表达量分别降低了20.68%,13.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.慢性饮水染铝可对大鼠海马LTP产生抑制作用,并且随着铝暴露时间的延长和剂量的增加,损伤趋于加重;2.慢性饮水染铝呈可致PHF8酶活性受到抑制且蛋白表达减少、H3K9me2蛋白表达增加、BDNF的蛋白表达减少;3.铝可能通过PHF8-H3K9me2-BDNF通路对大鼠海马LTP产生影响;4.铝可能通过对组蛋白甲基化修饰产生影响,进而引起学习记忆相关蛋白表达的改变。本课题由国家自然科学基金“组蛋白赖氨酸甲基化修饰调控铝神经毒性的机制研究(编号:81372968)”资助