【摘 要】
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MicroRNA（miRNA）是一类内源性,长度约为20-24个核苷酸的非编码单链小RNA。目前,越来越多的miRNA被发现在肌肉发育中起着重要作用。其中,有些miRNA参与成肌细胞的分化,例如miR-133以及miR-432等;还有一些miRNAs可以特异地调节肌纤维类型的形成例如miR-208b和miR-499等。但是,仍有许多miRNA在肌发生中尚未被发现。miR-129-5p在先前已经有诸
【基金项目】
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国家自然科学基金（31501925）；
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MicroRNA（miRNA）是一类内源性,长度约为20-24个核苷酸的非编码单链小RNA。目前,越来越多的miRNA被发现在肌肉发育中起着重要作用。其中,有些miRNA参与成肌细胞的分化,例如miR-133以及miR-432等;还有一些miRNAs可以特异地调节肌纤维类型的形成例如miR-208b和miR-499等。但是,仍有许多miRNA在肌发生中尚未被发现。miR-129-5p在先前已经有诸多的研究,但是大多集中于肿瘤,关于miR-129-5p在骨骼肌发育中还未见报道。在其调控机制中,lncRNA作为ceRNA吸附miRNA解除其对靶基因的抑制作用是其影响体内外功能的主要方式。此外,本实验室前期的测序表明miR-129-5p在大白猪的背最长肌（longest dorsal muscle,LD）和比目鱼肌（soleus,Sol）中差异表达,这表明miR-129-5p可能与肌肉发育有关。同时,lncMalat1是一种在骨骼肌中高表达的非编码RNA。因此,本试验以小鼠C2C12细胞为模型,旨在探究miR-129-5p在骨骼肌成肌细胞在增殖分化中的作用及上下游相关调控机制。本文以C2C12细胞为材料,分别合成了miR-129-5p的模拟物agomir以及干扰剂antagomir分别提高以及降低miR-129-5p的表达从而研究miR-129-5p在成肌增殖及分化过程中的作用;利用在线软件预测miR-129-5p的下游靶基因并构建双荧光素报告载体进行验证;构建靶基因过表达载体进行靶基因恢复验证;最后,在线软件预测miR-129-5p的结合LncRNA,研究miR-129-5p与LncRNA相互作用对骨骼肌成肌过程的影响。获得的主要结果如下:1.miR-129-5p对C2C12细胞成肌增殖影响不显著在C2C12成肌细胞增殖过程中,过表达miR-129-5p并未显著影响细胞的增殖过程,Ed U染色及CCK8活力检测也均未达到显著性水平;同样,干扰miR-129-5p之后检测细胞增殖的相关指标也未达到显著性水平。2.miR-129-5p抑制C2C12细胞成肌分化及慢肌相关基因的表达在C2C12成肌细胞分化过程中,过表达miR-129-5p之后,MyHC免疫荧光染色检测肌管融合及分化指数均显著下降,成肌分化标志基因MyHC、Myo D、Myo G以及慢肌标志基因MyHC I的m RNA水平及蛋白水平同样显著降低;相反,干扰miR-129-5p之后,肌管融合指数、分化指数、成肌相关基因以及慢肌相关基因的表达均显著提高。3.Mef2a是miR-129-5p抑制C2C12细胞成肌分化过程中的靶基因在线软件预测得到了miR-129-5p的候选靶基因Mef2a,这得到了双荧光素酶系统结果的验证;Mef2a无论是m RNA还是蛋白在分化过程中表达都逐渐升高,而过表达miR-129-5p可以降低Mef2a的表达;过表达Mef2a可以解除miR-129-5p对成肌分化的抑制作用。4.Malat1与miR-129-5p相互作用调控C2C12细胞成肌分化在线网站预测得到了miR-129-5p的上游调控候选LncRNA Malat1,双荧光素酶报告载体系统验证了这一结果;Malat1在小鼠比目鱼肌中表达较高于胫骨前肌及腓肠肌约2倍;Malat1对C2C12细胞成肌分化有促进作用,过表达及干扰结果均得到了这一结果;此外,过表达Malat1可以通过吸附miR-129-5p促进成肌分化,且促进MyHC I型表达。综上所述,miR-129-5p通过特异性靶向Mef2a抑制C2C12细胞成肌分化及慢肌基因的表达;此外,LncMalat1通过吸附miR-129-5p促进C2C12细胞成肌分化及慢肌纤维表达。
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