阴沟肠杆菌嗜盐α-淀粉酶的基因克隆、表达及嗜盐特性研究

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利用PCR技术从广西大学奶牛厂的奶牛粪便土壤中混合培养微生物的总DNA中克隆得到一个来自非嗜盐性的阴沟肠杆菌的α-淀粉酶基因,将该淀粉酶基因克隆到大肠杆菌JM109中进行重组表达,经破胞提取胞内总蛋白测定淀粉酶活力,当以可溶性淀粉为底物时检测不到淀粉酶活力,当在反应缓冲液中添加NaCl时能检测到淀粉酶活力,说明该基因是一种嗜盐淀粉酶的基因。纯化重组酶的酶学性质研究结果表明,该酶以可溶性淀粉为底物时,最适反应温度为50℃;最适pH为6.0,NaCl终浓度在4 mol/L时,酶活力最强,在盐浓度为5.5 mol/L时,仍能保持最高酶活的60%,属于极端的嗜盐酶,水解产物的特性属于α-淀粉酶。  通过该嗜盐α-淀粉酶的氨基酸组成分析,其酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)含量达15.8%,高于一些非嗜盐淀粉酶酸性氨基酸的10%含量。将嗜盐淀粉酶与非嗜盐淀粉酶的氨基酸序列进行分析比对,选取保守区中某一位置大多嗜盐酶与非嗜盐酶所不相同的氨基酸进行定点突变或者饱和突变,从而进行嗜盐机理的研究。从实验结果可推测出丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)、天冬酰胺(N)确实能降低酶对NaCl的依赖性,使嗜盐酶在无NaCl的情况下,也能表现出酶活,同时,不同突变位点和不同氨基酸的选择对酶活也会产生不同的影响。
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