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目的:氯化血红素(Hemin)是用于治疗贫血的药物。研究表明,Hemin在脑缺血/缺氧损伤中具有保护作用,但Hemin对脑缺血/缺氧后的海马神经元能否产生保护作用,在离体水平和整体水平有着相反的结果。
因此,本实验采用大鼠四血管闭塞全脑缺血再灌模型,观察Hemin对大鼠全脑缺血8min再灌注后海马神经元损伤的影响,并在此基础上从脑红蛋白(neuroglobin,Ngb)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2)蛋白等方面探讨Hemin预处理的脑保护机制,从而为临床上脑血管疾病的防治研究提供新的线索和依据。
1氯化血红素对大鼠全脑缺血/再灌注后海马形态学改变及神经元凋亡率的影响
方法:将84只预先凝闭双侧椎动脉的雄性Wistar大鼠(270-320 g)随机分为5组:
(1)假手术组(sham)(n=12):行全脑缺血的sham手术,即只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流。
(2)Hemin对照组(control)(n=12):于sham手术前24 h和10min分别腹腔注射Hemin(60umol.kg-1),共2次,其它同sham组。
(3)全脑缺血/再灌注组(I/R)(n=12):全脑缺血8 min后恢复血液再灌流,其它同sham组。
(4)Hemin预防组(Hemin prevention)(n=24):于全脑缺血前24 h和10min分别腹腔注射Hemin,共2次。根据Hemin的剂量,进一步分为30umol.kg-1、60 umol.kg-12个亚组。其它同I/R组。
(5)Hemin治疗组(Hemin therapy)(n=24):全脑缺血8 min恢复血液再灌流后即刻和24h分别腹腔注射Hemin,共2次。根据Hemin的剂量进一步分为30umol.kg-1、60umol.kg-12个亚组。其它同I/R组。
每组12动物。(1)海马CA1区锥体神经元迟发性死亡(delayedneuronal death,DND)(n=6):于sham手术或脑缺血后7 d取材,采用光镜观察海马组织学分级(histological grade,HG)及神经元密度(neuronaldensity,ND)。(2)海马凋亡率情况(n=6):于sham手术或脑缺血后3 d取材,应用流式细胞技术观察海马凋亡率变化。
结果:
硫堇染色结果显示,sham组大鼠海马CA1区无锥体细胞缺失,锥体细胞排列整齐。Hemin对照组大鼠海马CA1区组织形态与sham组基本一致。I/R组大鼠海马CA1区神经元大量丢失,DND明显,HG显著升高,ND显著下降(P＜0.05)。Hemin预防组DND被明显抑制,与I/R组相比表现为HG明显降低,ND明显升高(P＜0.05)。表明Hemin预处理有效地预防了全脑缺血引起的海马CA1区锥体神经元的DND。而Hemin治疗组海马CA1区出现明显的DND,其组织学特征与脑缺血组无明显差异,表明全脑缺血后应用Hemin不能减轻全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元DND。
海马神经元凋亡率显示,Sham组和Hemin对照组海马神经元凋亡率均较低,两组之间无显著性差异(P＞0.05)。I/R组海马神经元凋亡率较sham组显著升高(P＜0.05)。与I/R组比较,Hemin预防组2个亚组海马神经元凋亡率均明显降低(P＜0.05)。Hemin治疗组与脑缺血组比较无显著性差异(P＞0.05)。
以上结果表明:Hemin预防性给药能够减轻大鼠全脑缺血/再灌注后引起的海马CA1区锥体神经元的DND;抑制了全脑缺血/再灌注诱导的海马神经元凋亡,从而发挥了对全脑缺血/再灌注后海马的保护作用。而全脑缺血后应用Hemin不能有效减轻全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元凋亡和DND。
2氯化血红素预处理对全脑缺血/再灌注后海马保护作用的机制初探方法:将30只凝闭双侧椎动脉的动物随机分为4组:
(1)假手术组(sham)(n=6):行全脑缺血的sham手术,即只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流。
(2)全脑缺血/再灌注组(I/R)(n=6):全脑缺血8 min后恢复血液再灌流,其它同sham组。
(3)Hemin预防组(Hemin prevention)(n=12):于全脑缺血前24 h和10min分别腹腔注射Hemin,共2次。根据Hemin的剂量,分为30umol.kg-1、60umol.kg-12个亚组。其它同I/R组。
(4)Hemin治疗组(Hemin therapy)(n=6):全脑缺血/再灌注后即刻腹腔注射60umol.kg-1一次。其它同I/R组。
每组6动物。所有大鼠于sham手术或末次缺血再灌后1天取材。应用免疫组织化学方法观察海马CA1区Ngb及Bcl-2蛋白的表达。
结果:
Bcl-2免疫组织化学检测发现,sham组大鼠海马CA1区于术后1 d可见到少量Bcl-2阳性细胞,其染色较浅。I/R组Bcl-2表达与Sham组相比平均光密度和阳性染色面积均显著升高(P＜0.05)。Hemin预处理组于全脑缺血后1 d可见大量Bcl-2阳性细胞广泛分布于海马CA1区,尤其以大剂量Hemin亚组明显,与I/R组相比,其平均光密度和阳性染色面积均显著升高(P＜0.05)。Hemin治疗组与I/R组相比,其平均光密度和阳性染色面积未见显著升高,无统计学差异(P＞0.05)。
Ngb免疫组织化学检测发现,sham组大鼠海马CA1区于术后1 d可见到少量Ngb阳性细胞,其染色较浅。I/R组在锥体细胞层可见极少量Ngb阳性细胞,染色较浅,与sham组相比,其平均光密度和阳性染色面积均显著降低(P＜0.05)。Hemin预处理组于全脑缺血后1 d可见大量Ngb阳性细胞广泛分布于海马CA1区,尤其以大剂量Hemin预处理组明显,与I/R组相比,其平均光密度和阳性染色面积均显著升高(P＜0.05)。Hemin治疗组与I/R组相比,其平均光密度和阳性染色面积未见显著升高,无统计学差异(P＞0.05)。
以上结果表明,预防性给予Hemin可上调全脑缺血/再灌注后大鼠海马CA1区Ngb和Bcl-2蛋白的表达。这些作用可能是Hemin维持缺血/再灌注期间神经元存活,抑制神经元凋亡的重要机制。
结论:
(1)预防性给予Hemin减轻了大鼠全脑缺血/再灌注后引起的海马CA1区锥体神经元的DND;抑制了全脑缺血/再灌注诱导的海马神经元凋亡,从而发挥了对全脑缺血/再灌注后海马的保护作用。而全脑缺血后应用Hemin不能有效减轻全脑缺血打击引起的海马CA1区锥体神经元凋亡和DND。
(2)预防性给予Hemin上调了全脑缺血大鼠海马CA1区Ngb与Bcl-2蛋白的表达。
(3)这些结果提示,预防性给予Hemin可以发挥对全脑缺血/再灌注后海马的保护作用,上调Ngb和Bcl-2蛋白的表达可能是其发挥脑保护作用的机制之一。