目的:　　1.观察成骨前体细胞β-catenin持续性激活小鼠骨量的变化，探讨成骨前体细胞中β-catenin信号调节骨量的作用与机制;　　2.观察蛇床子、女贞子药对及其单体成分蛇床子素、女贞苷早期干预对去卵巢小鼠骨量的影响;初步探讨其缓解去卵巢小鼠骨量丢失的作用机制，以期为后续研究与防治原发性骨质疏松症提供新的思路。　　方法:　　一、成骨前体细胞β-catenin持续激活对小鼠骨量的影响　　取Axin1fx/fx小鼠原代颅成骨前体细胞，感染Adeno-Cre-GFP后，分别通过RT-PCR和Western Blot检测Axin1基因和Axin1、active-β-catenin蛋白的表达水平。利用Osterix-cre小鼠与Axin1fx/fx小鼠进行配对繁殖，建立成骨前体细胞β-catenin持续激活小鼠模型（即Osterix-cre，Axin1fx/fx或Axin1Osx小鼠），通过体内外实验对该小鼠进行观察。以同窝Cre阴性小鼠（即Axin1fx/fx或Cre-小鼠）作为对照，分别取4周、14周、24周的Cre-小鼠和Axin1Osx小鼠，对第五腰椎、下肢胫骨行Mirco-CT扫描，比较骨量改变;行藏红固绿染色，观察形态学改变。在此基础上对4周龄小鼠胫骨组织行TRAP染色观察其破骨细胞数目;免疫组化观察胫骨相关破骨蛋白的表达情况。取3天龄Cre-和Axin1Osx小鼠，分离培养颅骨中的成骨前体细胞，培养3天后收集培养基，并提取细胞RNA，行RT-PCR观察Opg、Rankl以及Opg/Rankl的表达水平;取原代骨髓单核巨噬细胞，用M-CSF、RANKL诱导其破骨细胞形成，并用Cre-和Axin1Osx原代成骨前体细胞的培养基（条件培养基）干预诱导7天后进行TRAP染色观察破骨形成情况;另取4周龄Cre-小鼠和Axin1Osx小鼠胫骨，通过免疫组化染色观察OPG、NFATc-1以及c-Fos蛋白的表达情况。　　二、蛇床子、女贞子药对及其单体成分（蛇床子素、女贞苷）早期干预去卵巢小鼠缓解骨量丢失的作用与机制研究　　取3月龄雌性小鼠，建立去卵巢（ovariectomized，OVX）小鼠模型，随机均分为8组，假手术组、模型组、药对A组（蛇床子12g、女贞子6g）、药对B组(蛇床子9g、女贞子9g)、药对C组（蛇床子6g、女贞子12g）、蛇床子素组、女贞苷组、雷洛昔芬组，每组10只。于造模完成后5天开始给药干预。给药过程中每周称量体重一次，给药8周后取材。Mirco-CT扫描第五腰椎，观察各组小鼠骨量的影响;藏红固绿染色观察各组小鼠的第五腰椎组织形态改变;ELISA法检测血清成骨/破骨相关标志物、OPG以及E2的表达水平;TRAP染色观察各组小鼠第五腰椎椎体破骨细胞数目;免疫组织化学染色观察各组小鼠第五腰椎椎体中破骨细胞特异性蛋白以及OPG、active-β-catenin蛋白的表达情况。RT-PCR检测小鼠腰椎成骨、破骨细胞特异性基因以及Opg、Rankl和Tcf1的表达水平。　　三、蛇床子素、女贞苷抑制骨吸收的作用与机制研究　　1.分离原代骨髓单核巨噬细胞，在M-SCF、RANKL诱导破骨形成的基础上用不同剂量的蛇床子素、女贞苷分别干预，干预后1天、2天、4天分别检测破骨相关基因表达水平，干预后6天行TRAP染色观察破骨细胞形成情况。　　2.分离原代成骨前体细胞，采用不同浓度蛇床子素、女贞苷干预，检测干预3天、6天后成骨相关基因与Wnt/β-catenin信号下游靶基因的表达情况。收集培养6天的培养基，ELISA检测该培养基中OPG的含量。分离原代骨髓单核巨噬细胞，M-SCF、Rankl诱导破骨细胞形成的基础上，用蛇床子素、女贞苷干预的成骨前体细胞培养基分别进行干预，于干预后4天检测破骨相关基因表达水平，并于干预后6天行TRAP染色观察破骨细胞形成情况。　　结果:　　一、成骨前体细胞β-catenin过表达对小鼠骨量的影响　　Adeno-cre-GFP感染后Axin1fx/fx小鼠成骨前体细胞中Axin1基因和蛋白表达量明显降低，active-β-catenin蛋白表达量增加。免疫组织化学染色结果显示Axin1Osx小鼠胫骨组织中active-β-catenin蛋白显著增加。Axin1Osx小鼠的腰椎、胫骨骨量也明显增加;4周龄Axi1Osx小鼠胫骨TRAP染色阳性表达明显减少。免疫组化显示4周龄Axin1Osx小鼠胫骨OPG表达增加，MMP9、Cathepsin K、NFATc-1和c-Fos的表达下降。RT-PCR显示Axin1Osx小鼠原代成骨前体细胞中，Opg、Rankl以及Opg/Rankl均明显增加;采用原代成骨前体细胞的培养基干预破骨细胞形成，TRAP染色显示相较于Cre-成骨前体细胞，Axin1Osx成骨前体细胞的培养基具有抑制破骨细胞形成的作用。　　二、蛇床子、女贞子药对及其单体成分（蛇床子素、女贞苷）早期干预去卵巢小鼠缓解骨量丢失的作用与机制研究　　与模型组相比，各给药组小鼠体重上升明显缓解。Mirco-CT与藏红固绿染色显示，给药8周后各给药组小鼠骨量均有不同程度增加。ELISA结果显示，各给药组小鼠血清β-CTX、TRACP-5b、CTX-Ⅰ表达均明显降低;BALP、PINP（除雷洛昔芬组外）的表达无明显变化;E2、OPG表达也明显增高。TRAP染色显示，各给药组小鼠TRAP染色阳性表达明显降低。免疫组织化学染色显示，Cathepsin K、NFATc-1的蛋白表达均降低，OPG、active-β-catenin的蛋白表达量明显增高。RT-PCR结果显示，各给药组小鼠腰椎椎体Runx2、Alp表达无显著差异（雷洛昔芬组除外）;Cathepsin K、Trap、Mmp9以及Rankl表达均明显降低，Tcf1、Opg和Opg/Rankl的表达明显增加。　　三、蛇床子素、女贞苷对骨形成与骨吸收的作用与机制研究　　1.TRAP染色结果显示，不同浓度蛇床子素、女贞苷干预6天后，破骨细胞形成数目均减少。同浓度下，女贞苷组TRAP阳性表达均低于蛇床子素。RT-PCR结果显示，不同浓度蛇床子素、女贞苷干预细胞1天、2天、4天后，破骨相关基因表达水平均有降低。　　2.RT-PCR结果显示，不同浓度蛇床子素、女贞苷干预细胞3天后Tcf1表达增加，Opg水平无明显变化;干预6天后Opg的表达水平开始增加。ELISA检测结果显示，不同浓度蛇床子素、女贞苷干预6天后，培养基中OPG的表达水平均增高，同浓度下，蛇床子素干预下的培养基OPG水平高于女贞苷。TRAP染色结果显示，不同浓度蛇床子素、女贞苷条件性培养基干预6天后，破骨细胞形成数目均减少。同浓度下，女贞苷组与蛇床子素组破骨细胞形成数目无明显差异。RT-PCR结果显示，不同浓度蛇床子素、女贞苷条件性培养基干预4天后，破骨相关基因表达降低。相比于同浓度蛇床子素，10-7M浓度女贞苷条件培养基破骨相关基因的表达均明显降低。　　结论:　　1.成骨前体细胞中β-catenin持续激活，细胞分泌OPG增加，Opg/Rankl上调，抑制了RANK下游信号通路的激活，从而抑制破骨细胞生成，增加骨量。　　2.蛇床子、女贞子药对及其单体成分蛇床子素、女贞苷早期干预去卵巢小鼠，能有效减轻小鼠去卵巢导致的骨量丢失，可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路，刺激下游Tcf1生成，促进了OPG的表达，从而抑制去卵巢小鼠的破骨形成和骨吸收。　　3.蛇床子素、女贞苷可以直接抑制破骨细胞形成，女贞苷的抑制作用更明显。蛇床子素、女贞苷还可以促进成骨前体细胞分泌OPG，进而抑制破骨细胞生成，蛇床子素具有更强促成骨前体细胞分泌OPG的作用。