目的：　　溃疡性结肠炎（UC）被世界卫生组织列为现代难治病之一，目前我国的UC发病率呈逐年上升的趋势。UC与核因子-κB（NF-κB）的关系已引起了人们的高度重视，成为当今研究的热点。许多研究表明，NF-κB作为炎症介质和免疫相关基因的转录与表达的重要调控因子，在UC的发生与发展中起着关键作用。IKK/IκB/NF-κB这一环节被认为是NF-κB活化的共有通路部分：高表达的蛋白激酶能够激活IKK，被活化的IKK能够诱导NF-κB抑制蛋白IκB发生磷酸化进而发生泛素化降解，从而使NF-κB得以释放，迅速从细胞质易位到细胞核，发挥调控功能。而泛素系统（又称泛素-蛋白酶体系统）介导的蛋白质降解过程是 IκB降解的主要途径，因此泛素及泛素蛋白连接酶E3也是我们研究的重要靶标。本实验通过对NF-κB的泛素化机制的研究，揭示溃结灵治疗UC的深层次作用机理。　　溃结灵是脾胃研究所在多年的临床经验上总结出来的对治疗 UC有较满意疗效的中药复方，我们前期已有多项动物实验证实了其对三硝基苯磺酸（TNBS）法 UC大鼠模型结肠黏膜炎症相关因子表达的作用，如COX-2,iNOS,TGF-α、TNF-α、IL-1β等。证据显示溃结灵能够下调大鼠结肠粘膜 NF-κB p65蛋白表达并且能够通过调节 IKKβ、 IκBα的表达干预NF-κB信号通路。　　Caco-2细胞模型是目前较为理想的体外肠吸收研究工具,由于其与药物的体内吸收具良好的相关性,近年来Caco-2细胞模型在中药研究中越来越受到重视。为了进一步探讨溃结灵抑制NF-κB的泛素化机制，我们用IL-1β刺激Caco-2细胞建立NF-κB活化细胞模型，检测溃结灵对细胞样本中 NF-κB p65的DNA结合活性的影响，及IKKβ、IκBα、泛素及E3(E3RSI?B)的基因和蛋白表达。　　方法与结果：　　1、 Caco-2细胞的培养及药物对细胞毒性的检测　　Caco-2细胞来源于人体结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，该细胞模型作为药物吸收研究的一种快速的筛选工具，已经被广泛认可。但由于细胞来源的不同及细胞分化过程中的异质性，不同实验室培养出的细胞特性会有不同程度的差异，因此实验前对于细胞生长曲线的测定显得格外重要。xCELLigence细胞动态分析仪，能够对细胞生长进行实时动态的监测，并且大大提高了实验的效率，因此用其来检测细胞生长曲线，并用MTT的方法来检测溃结灵含药血清对细胞生长的影响。　　方法：Caco-2细胞按照脾胃所已经建立的细胞培养方法来进行细胞复苏、传代和冻存。细胞生长汇合达到80%左右时进行传代培养，通常按1：3比例传代，约2-3d可传一代。用细胞动态仪检测细胞的生长曲线，并用MTT的方法测定含药血清对细胞生长状态的影响，并进行统计学分析。　　结果：Caco-2细胞生长状态良好，在3-4天进入平台期；和空白组相比，溃结灵含药血清各剂量组在48h内对Caco-2细胞的生长并无明显差异（P>0.05）　　2、溃结灵含药血清对IL-1β诱导的Caco-2细胞NF-ΚB p65 DNA结合活性的影响　　NF-κB是一种重要的转录调节因子,能调节多种炎症和免疫基因的转录和表达。在静息状态下，NF-κB以无活性的状态存在于细胞浆中，与其抑制蛋白 IκB偶联,一旦被炎症细胞因子等刺激剂激活后便与 IκB解离而转入细胞核内与特异的κB序列结合,从而调控基因的表达，发挥生物学效应。因此本实验采用IL-1β刺激Caco-2细胞建立炎症模型，观察NF-κB p65 DNA结合活性。　　方法：将对数生长期的Caco-2细胞分成七个组：空白组、模型组、阳性药组（SASP）、蛋白酶体抑制剂硼替佐米组、溃结灵高、中、低剂量组，用炎症因子IL-1β诱导Caco-2细胞建立NF-κB活化细胞模型，提取其核蛋白，检测该细胞核蛋白NF-κB p65的DNA结合活性，进行统计学分析。　　结果：模型组中IL-1β刺激的细胞NF-κB p65相对活性明显高于正常组（P﹤0.01），溃结灵高、中剂量组中细胞 NF-κB p65相对活性均明显低于模型组（P﹤0.01）。　　3、溃结灵对IL-1β诱导的Caco-2细胞IKKβ、IΚB? mRNA与蛋白表达的影响　　IKK/IκB/NF-κB这一环节被认为是NF-κB活化的共有通路，活化的IKK能促使IκB发生磷酸化进而发生泛素化降解，因而在激活NF-κB信号通路的过程中有重要地位。　　方法：将处于对数生长期的Caco-2细胞分成七个组：空白组、模型组、蛋白酶体抑制剂硼替佐米组、阳性药组（SASP）、溃结灵高、中、低剂量组；用 IL-1β刺激细胞建立NF-κB活化细胞模型，提取其全蛋白及总RNA,采用Western blot方法检测Caco-2细胞IκB?、IKKβ蛋白相对表达量，用实时定量荧光PCR方法检测Caco-2细胞IκB?、IKKβmRNA表达，并进行统计学分析。　　结果：模型组中IL-1β诱导的Caco-2细胞IκB? mRNA表达明显低于正常组(P﹤0.05)，溃结灵中剂量组IκB? mRNA表达明显高于模型组(P﹤0.05)；IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组IKKβ mRNA表达明显高于正常组(P﹤0.05)，溃结灵各剂量组IKKβ mRNA表达明显低于模型组，但无统计学差异(P>0.05)；IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组IκB?蛋白表达明显低于正常组,但无统计学差异(P>0.05)，溃结灵高剂量组 IκB?蛋白表达明显高于模型组(P﹤0.01)；IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组IKKβ蛋白表达明显高于正常组(P﹤0.01)，溃结灵高剂量组IKKβ蛋白表达明显低于模型组(P<0.01)。　　4、溃结灵对IL-1β诱导的Caco-2细胞泛素、E3RSI?B mRNA与蛋白表达的影响　　泛素蛋白酶体通路是细胞内蛋白质降解的主要途径，具有多种生物学调节功能，对免疫信号转导过程中NF-κB信号调控尤为明显。讨论IΚB的泛素化机制对NF-κB信号通路的研究有着重要意义。　　方法：将处于对数生长期的Caco-2细胞分成七个组：空白组、模型组、蛋白酶体抑制剂硼替佐米组、阳性药组（SASP）、溃结灵高、中、低剂量组；用 IL-1β刺激细胞建立NF-κB活化细胞模型，收集细胞标本。采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测 Caco-2细胞泛素、荧光定量 PCR的方法检测 E3RSIκB mRNA表达，Elisa法检测Caco-2细胞泛素和E3RSIκB蛋白含量。　　结果：IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组泛素 mRNA相对表达量高于正常组，但无统计学意义(P﹥0.05)，溃结灵各剂量组泛素 mRNA相对表达量低于模型组，亦无统计学意义(P﹥0.05)；IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组 E3RSIκB mRNA相对表达量明显高于正常组(P﹤0.05)，溃结灵高剂量组E3RSIκB mRNA相对表达量明显低于模型组(P﹤0.05)；IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组泛素蛋白含量高于正常组( P<0.05)，溃结灵中、低剂量组泛素蛋白含量低于模型组(P<0.05)；IL-1β诱导的Caco-2细胞模型组E3RSIκB蛋白含量明显高于正常组(P﹤0.05)，溃结灵高、中、低剂量组E3RSIκB蛋白含量明显低于模型组(P﹤0.01,P﹤0.05)。　　结论：　　Caco-2细胞株在本实验室条件下呈现生长稳定状态，溃结灵含药血清对该细胞株没有明显的生长抑制作用。通过荧光定量PCR法、ELISA及 WesternBlot等技术，发现溃结灵含药血清能够对IL-1β诱导的Caco-2细胞IκB? mRNA和蛋白表达有上调作用及对IKKβ蛋白表达有下调作用，并对E3RSIκB mRNA和蛋白表达有抑制作用，对泛素蛋白表达有下调作用，认为溃结灵通过抑制NF-κB信号通路中IκB的泛素化降解干扰 NF-κB p65活化入核，这与实验二中溃结灵含药血清抑制 NF-κB p65DNA结合活性的结论相一致，因此推测其可能为溃结灵减轻炎症反应、治疗 UC的作用机理之一。