龟鳖类是地球上较古老且形态最为特化的一支爬行动物,全世界现生的约有450余种。近二十年来,由于人为的大量捕杀以及宠物贸易的影响,闭壳龟类多数物种的野生种群数量已十分稀少,均在2006年被IUCN列为极其濒危的类型(除了安布闭壳龟是脆弱种群,黄缘盒龟为濒危种群),因此,其保护生物学和系统进化研究十分迫切。至2010年5月,GenBank正式公布出的龟鳖类动物线粒体基因组全序列只有34种,其中具闭壳结构的龟类有5种。为更好地探讨闭壳结构龟类的属间关系,以期为该类动物的保护提供理论依据,本文对具闭壳结构的黄缘盒龟(Cistoclemmys flavomarginata)和黄额盒龟(Cistoclemmys galbinifrons)进行了线粒体基因组全序列的测定。本研究采用PCR、LA-PCR及测序技术获得了两种龟的线粒体全基因组序列并对其进行了生物信息学分析。黄缘盒龟和黄额盒龟线粒体基因组全长分别为16 721 bp、17 244 bp;均含有22个tRNA、2个rRNA和13个蛋白编码基因及一个非编码控制区(Control region,CR);其基因组结构、基因排列顺序和碱基组成均与典型的脊椎动物相似,显示龟鳖类线粒体基因组在进化上十分保守。与多数龟鳖类mtDNA一致,黄缘盒龟和黄额盒龟ND3基因的第174位点存在一个额外插入的单核苷酸(A)。本文还比较分析了5种具闭壳结构龟类(黄缘盒龟、黄额盒龟、金头闭壳龟Cuora aurocapitata、锯缘龟Pyxidea mouhotii和白腹摄龟Cyclemys atripons)的控制区序列,其长度范围为980 bp-1 722 bp,均含有终止相关序列(TAS)和几个保守序列框(CSB-F和CSB1-3)。此外,在5种闭壳龟类CR区的3’末端,均发现了多种基序类型的可变数目串联重复序列(variable number of tandem repeats, VNTR)或称为微卫星(microsatellites)序列;这些龟类共有7种微卫星基序(2-8 bp),重复4-48次,由A、T、C碱基构成。基序及重复次数的不同造成了控制区长度的差异。比较种间微卫星基序的异同,可以为龟鳖类动物的系统学研究、亲缘关系分析、物种多样性保护和研究等提供重要的参考指标。选取已登陆GenBank的22种龟鳖动物做内群,2种鳄做外群,基于线粒体12个蛋白编码基因核苷酸序列的合并序列数据,用最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)重建龟鳖类动物的系统发生树,探讨了龟鳖类动物主要分类群的系统发生关系和具闭壳结构龟类的属间关系。结果表明:闭壳龟属、盒龟属(Cistoclemmys)和单种锯缘龟属(Pyxidea)聚成一个单系的闭壳龟群(Cuora group),建议将它们合并为闭壳龟属(Cuora);齿缘龟属(Cyclemys)与眼斑龟属(Sacalia)的亲缘较近,而与闭壳龟属关系较远,揭示闭壳结构的形成不是由一个共同祖先分化而来;乌龟属(Chinemys)和拟水龟属(Mauremys)为并系起源,建议可以合并为一属;平胸龟科(Platysternidae)与龟科(Emydidae)互为姐妹群;淡水龟科(Geoemydidae、Bataguridae)和陆龟科(Testudinidae)亲缘关系较近,二者互为姐妹群,而不是与龟科。